新疆野苹果优选无性系DNA指纹图谱构建及亲缘关系鉴定

李昕蔓,庞丁玮，2,柳俊明,王立成,李清泉,张军

(1 河北农业大学 林学院，河北 保定 071000；2 河北雾灵山国家级自然保护区管理局， 河北 兴隆 067300；3 保定市满城区苗圃场，河北 满城 072150)

新疆野苹果[Malussieversii(Ledeb.) Roem]是与栽培苹果品种亲缘关系最近的野生种[1-3]。Richards等的研究证明，新疆野苹果是第三世纪的1种残遗植物，是栽培苹果品种的祖先种，其主要分布在天山山脉西部的托里县、巩留县、霍城县、新源县、额敏县等地区[4-5]。新疆野苹果种质资源极其丰富，被认为是经济林树种中唯一的天然基因库，也是世界野苹果基因库的重要组成部分[6-7]。新疆野苹果适应性和抗性很强，具有抗寒、抗旱、抗病、耐虫、耐瘠薄等优良特性，并且变异丰富。

简单序列重复(Simple sequence repeats，SSR)，是一种由1～6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于植物基因组中[8-15]。随着分子生物技术的不断发展，亲缘关系鉴定及遗传多样性分析也从表观遗传学水平的研究逐渐深入到分子水平，尤其是最近几年，SSR分子鉴定技术已经广泛应用于各种植物的品种分类鉴定、种质资源评价和利用、DNA指纹图谱构建、遗传多样性检测与分析、分子标记辅助选择育种等方面，极大地推动了分子技术的进步[16]。

部分学者对新疆野苹果PCR反应体系及SSR亲缘关系鉴定方面进行了初步探究，取得了一定的研究进展。张云秀等研究了新疆野苹果PCR反应体系中各成分的浓度对PCR扩增结果的影响，最终得到了新疆野苹果最佳反应体系[7]。Zuo等以18个新疆野苹果无性系为研究对象，对叶形性状和SSR分子标记进行关联分析，说明叶形性状与部分SSR位点关联比较紧密[17]。李政等利用SSR分子标记技术对包括新疆野苹果无性系、鲜食苹果品种、苹果砧木品种等3类苹果属种质资源进行了遗传多样性、亲缘关系以及引物的效率值分析，结果表明，新疆野苹果的遗传多样性高于鲜食苹果和苹果砧木品种；鲜食苹果起源于新疆野苹果；选择的引物不同，其遗传参数和效率值不同[18]。马衣努尔姑·吐地等利用SSR分子标记技术，用4对引物构建62个新疆野苹果品种的指纹图谱，并对其亲缘关系进行了鉴定，将其分为4大类群，又以核型特征与遗传图谱结合，使新疆野苹果种下类型间的亲缘关系更加清晰明确[19]。秦伟等利用SSR分子标记技术对21份新疆当地苹果品种进行亲缘关系鉴定，结果表明，新疆当地苹果品种是由新疆野苹果驯化而来的，也可能是杂交育种或者栽培过程中出现的遗传变异形成的[20]。

研究以18个新疆野苹果无性系为试验材料，基于SSR分子标记技术，对18个新疆野苹果无性系进行亲缘关系鉴定并构建DNA指纹图谱，以期为新疆野苹果的品种分类鉴定、种质资源评价和利用、分子标记辅助育种等方面的研究提供科学的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的18个新疆野苹果无性系是2010年从新疆天山地区新源县、巩留县采集的600株新疆野苹果野生单株中筛选出来的，选择树形端庄、优美，生长势旺盛，无病虫害的植株，于第2年嫁接在保定市满城区苗圃场的2 a生的海棠(Malusspectabilis)砧木上，每个无性系嫁接10株，苗木生长期间正常水肥管理。

每个无性系随机选取10片生长良好、无病虫害、成熟、无破损的叶片，放到-30 ℃的冰箱中保存备用，用于SSR分子鉴定。

1.2 试验方法

提取DNA采用改良的CTAB法[21]，用微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度，检测合格后，将所有DNA稀释至50 ng/μL，统一放到-30 ℃的冰箱中储存备用。

PCR扩增采用20 μL的反应体系，其中包括：50 ng/μL的DNA模板2 μL，rTaq聚合酶0.2 μL，DNTP0.5 μL，10×buffer2 μL，10 μM的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O14.3 μL。PCR反应程序为：预变性95 ℃ 5 min(1个循环)；变性95 ℃ 30 s，退火50～60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s(35个循环)；延伸72 ℃ 7 min(1个循环)。PCR产物用 8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶进行检测，在270 V电压下电泳30 min，然后用硝酸银溶液染色，氢氧化钠溶液显色，最后拍照，读带。SSR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。 SSR引物的选择详见表1。

表1 SSR引物的选择Table 1 Selection of SSR primers

1.3 数据处理

基于聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，用软件Excel统计SSR电泳分离出的多态性条带，并转换成0/1数据[22]。

用软件DPS 7.05用类平均法(UPGMA)绘制18个新疆野苹果无性系的聚类图。

用软件PIC Calc 0.6计算引物多态性信息量(PIC)。

2 结果与分析

2.1 SSR引物多态性分析

13对SSR引物的多态性分析见表2。

由表2可知，13对SSR引物共扩增出62条条带，每对引物扩增条带数在3～6条之间，其中引物CH03d12、CH02a04、CH05c04扩增条带(6条)最多，引物CH02d08和CH03g04扩增条带(3条)最少，平均每对引物扩增条带4.77条。每对引物的多态性位点数在3～6个之间，平均每对引物的多态性位点数为4.77个，各引物的多态位点百分比均为100%，各引物的PIC值在0.512～0.879之间，其中引物CH02a04的PIC值最高(0.879)，引物CH03g04的PIC值最低(0.512)。根据Botstein的理论，当PIC<0.25时，引物多态性较低，当0.250.5时多态性较高。按照此参数，本试验所用引物具有较高的多态性，能够较好的区分18个新疆野苹果无性系。

表2 SSR引物的多态性分析Table 2 Polymorphism analysis of SSR primers

2.2 18个新疆野苹果无性系DNA指纹图谱构建

18个新疆野苹果无性系DNA指纹二维码见图1。

图1 18个新疆野苹果无性系DNA指纹二维码Figure 1 DNA fingerprint two-dimensional code of 18 Xinjiang wild apple clones

随着分子标记技术的发展，DNA指纹图谱数量越来越庞大，DNA指纹图谱的构建有利于植物信息的长期保存，能够快捷、高效、大量的记录植物信息，并且其解码方便、易修改，便于工作者快速查询相关资料，为后续的科研工作提供科学的理论依据和参考，因此，进一步完善植物DNA指纹图谱显得尤为重要。

研究基于聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，利用草料二维码转换器构建了13对SSR引物扩增的18个新疆野苹果无性系的DNA指纹二维码(图1)，二维码内容包括图谱代码、引物名称及编号、引物序列、扩增片段数、扩增条带大小以及各无性系的基本特性。图谱代码由引物名称字母编码以及扩增出的片段大小数字编码组成。引物CH03g12、CH03g07、CH03d12、CH02a04、CH05f06，CH02a08、CH02d 08、CH01F02、CH05c04、CH01h01、CH04e0、CH04 f10、CH03g04分别编号为A～M，分别记录每个无性系经过以上13对引物扩增后的片段大小即bp值，以此生成每个新疆野苹果无性系的SSR图谱代码。例如：无性系M-1的SSR图谱代码是A200B 200C140/162D160E130F130G125H125I125J120K 170/190L110/120M180，该指纹代码表示的是无性系M-1在不同引物扩增下，扩增片段的bp值。

2.3 18个新疆野苹果无性系SSR聚类分析

18个新疆野苹果无性系SSR聚类分析见图2。

图2 18个新疆野苹果无性系SSR聚类分析Figure 2 SSR cluster analysis of 18 Xinjiang wild apple clones

由图2可知，18个新疆野苹果无性系可以被100%区分开，遗传距离的变化范围为0.182～0.598，平均遗传距离为0.459。在遗传距离为0.566处，18个新疆野苹果无性系被分为4类。第一类为M-1、M-14、M-13、M-16、M-3、M-4、M-6等7个无性系；第二类仅有M-15 1个无性系；第三类为M-2、M-5、M-9、M-11、M-12等5个无性系；第四类为M-7、M-17、M-18、M-8、M-10等5个无性系，并未完全按照地理起源分开，分析其主要原因可能是这18个新疆野苹果无性系的采集地点相对较近，不同群体间存在频繁的基因交流，几乎不存在天然阻隔。

3 结论与讨论

研究基于SSR分子标记技术用苹果属的13对SSR核心引物对18个新疆野苹果无性系进行亲缘关系鉴定并做了聚类分析及DNA指纹图谱构建，进一步为新疆野苹果品种分类鉴定、种质资源评价和利用、DNA指纹图谱构建、遗传多样性检测与分析、分子标记辅助选择育种等方面的研究提供参考。通过对每对引物分析可知，每对引物的多态性信息含量(PIC)各有不同，不同的引物之间存在一定差异。研究用13对SSR核心引物共扩增条带62条，平均扩增条带4.77条，多态位点百分比为100%，各引物的PIC值在0.512～0.879之间，引物的多态性比较丰富，每对引物能够检测到的信息量是有一定差距的，也充分说明了新疆野苹果的遗传资源极其丰富，遗传多样性较为广泛，具有较大的选择潜力，其主要原因是新疆野苹果在漫长的自然进化与人工选择的过程中，逐渐适应了当地的气候条件，遗传变异较为丰富，遗传多样性较高。这与Zuo L H[17]、李政[18]等对新疆野苹果遗传多样性的研究结果一致。

研究中13对SSR引物将18个新疆野苹果无性系分成了4类，聚类结果并未将其完全按地理起源划分开，其主要原因可能是这18个新疆野苹果无性系的收集地点距离较近，不同群体间没有天然阻隔，基因交流相对频繁[17]。

虽然有些学者也对新疆野苹果的种质资源进行过分子鉴定，但并没有构建其DNA指纹图谱，而本研究基于聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，利用草料二维码转换器构建了18个新疆野苹果无性系13对SSR核心引物扩增结果的DNA指纹二维码活码，该活码具有包含的信息量大、解码方便、快捷、高效、修改比较容易等优点，而得到广泛应用。在今后的科研中，我们要利用更多新疆野苹果种质资源及SSR引物构建二维码活码，提供更为全面准确的新疆野苹果DNA指纹图谱。