冷冻储藏下三唑类杀菌剂在香蕉中的残留稳定性研究

陈丽霞 陈歆 许丽建 彭黎旭

(1 琼台师范学院理学院 海南海口 571100;2 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口 571101)

三唑类杀菌剂近年来被广泛用于防治香蕉叶斑病、黑心病［1-3］，但是由于三唑类杀菌剂具有药效持续时间长、内吸输导性强等特点，在香蕉中通常具有较长的降解半衰期，容易在香蕉果实中带来残留风险，是香蕉样品中的最常见检出农药之一［4-6］。在香蕉样品的检测过程中，样品在采集制备后，通常不能立即检测，需要冷冻储藏一段时间后进行分析。在此过程中，残留的农药由于挥发或者发生一些水解、光解及酶促反应等可能会发生降解，有可能发生降解代谢，引起浓度变化，影响测定结果。因此，想要准确评估农药安全性，研究冷冻储藏下农药残留稳定性具有重要的意义［7-9］。有研究报道多种农药的储藏温度、样本基质及基质状态对农药残留的稳定性均有影响，但不同的农药影响大小各不相同，其中温度对农药的影响较为一致，冷冻条件下的农药残留最稳定［10-12］。

在我国GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中，明确规定香蕉的测定部位为全蕉，但是由于香蕉果肉和果皮的成分并不相同，农药在冷冻储藏过程中稳定性可能存在差异［13-14］，对香蕉中农药残留存在一定影响，但是目前尚未见相关研究报道。本研究选择丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑三种三唑类杀菌剂，研究其在香蕉全果、果肉和果皮中的稳定性，为香蕉中三唑类杀菌剂的残留检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

香蕉样品采自海南省澄迈县永发镇香蕉种植基地。

1.1.2 仪器

实验仪器包括AB SCIEX API4000＋质谱系统（AB SCIEX 公司），超高压液相色谱系统（Waters公司），UPLC®BEH C18 色谱柱 （50 mm×2.1 mm，1.7 μm）（沃特世科技（上海）有限公司）、高速离心机（IKA 公司）、多管涡旋混合机（北京同德创业科技有限公司）、高速匀浆机（IKA 公司）、微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）、电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）、精密移液枪、0.22 μm 有机微孔滤膜（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）。

1.1.3 试剂

实验用水均为超纯水（Millipore，USA），乙腈、甲醇（色谱纯，Fisher 试剂公司），氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂），PSA 吸附剂（N-丙基乙二胺，分析纯，Biocomma 公司）。含丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑的农药制剂，分别购自海口市农资店。丙环唑、戊唑醇标准品购自农业部环境质量监督检验测试中心（天津），苯醚甲环唑标准品购自德国Dr Eh-renstorfer GmbH公司。

1.2 方法

1.2.1 冷冻样品的制备

香蕉样品采集后，将果肉和果皮分离，同时取香蕉全果，将香蕉全果、果肉和果皮切块得到全果、果肉和果皮样品。分别称取500 g 香蕉全果、果肉和果皮样品。准确称取10.0 g 香蕉全果、果肉和果皮块状样品，装入50 mL 离心管，分别添加0.1 和3.0 mg/kg 的丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑的农药制剂水溶液，作为冷冻香蕉样品。在-20℃冷冻储藏，在预定时间取出，制备成为匀浆样品并进行分析。

1.2.2 样品前处理

在香蕉全果、果肉和果皮的空白样品中分别加入丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3 种杀菌剂，并记为0 d。在香蕉冷冻储藏后第15、30、60、90天，取样品进行分析，加入20 mL 乙腈，并高速匀浆2 min，加入氯化钠2 g，蜗旋剧烈震荡1 min后，以4 000 r/min 的转速离心5 min。取5 mL 上清液于PSA净化剂中，蜗旋剧烈震荡1 min，以4 000 r/min的转速离心 5 min，取上清液 2.0 mL 经 0.22 μm 微孔滤膜过滤，装入进样小瓶，使用UPLC-MS/MS 进行测定。

1.2.3 仪器分析条件

色 谱 条 件 ： ACQUITY UPLC®BEH C18 色 谱 柱（50 mm×2.1 mm×1.7μm）；柱温：35℃；进样量：10 μL；流速：0.25 mL/min；所用流动相为0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B）。梯度设置为：0～2 min：保持 95%A；2～4 min：A 从 95% 到 5%；4～5 min：保持5%A；5～7 min：A从5%到95%。

质谱条件：电喷雾正离子（ESI+）扫描，喷雾电压：5 000 V；毛细管温度：600℃；多反应监测（MRM）模式。定性和定量的离子、去簇电位（DP）和碰撞电压（CE）如表1所示。

表1 质谱工作条件

2 结果与分析

2.1 分析方法准确性及定量限

经预实验验证，香蕉样品存在一定的基质效应。为了保障数据的准确性，本实验均采用基质标准曲线。以浓度10 μg/mL 的丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3种杀菌剂混合标准溶液作为母液，分别用全果、果肉和果皮空白样品提取液逐级稀释法配置0.005、0.01、0.03、0.05、0.1、0.5 μg/mL的系列标准工作溶液，外标法进行定量。以丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑三种杀菌剂基质标准溶液浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。表2 列出了3 种杀菌剂在甲醇溶液中线性方程及相关系数，其中丙环唑和苯醚甲环唑灵敏度较差，0.005 μg/mL 信号稳定性较差，因此其线性范围为0.01～0.5 μg/mL，戊唑醇的线性范围为0.005～0.5 μg/mL。考虑到液质在测定目标物存在基质效应，样品测定时均采用空白样品提取液配制基质标准，其线性关系均优于0.999。方法测定丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3种杀菌剂的定量限分别为0.01、0.005和0.01 mg/kg。

表2 三种杀菌剂的标准曲线及相关系数

本研究分别选择定量限0.01 mg/kg 和最大的残留限量3.0 mg/kg，并设置中间浓度0.10 mg/kg进行添加回收率实验，分别在香蕉全果、果肉和果皮样品中添加0.01、0.10 和3.0 mg/kg 三个不同浓度的3种杀菌剂，并通过回收率判定分析方法的准确性。表3 列出了在0 d 时测定三种杀菌剂的添加回收率与相对标准偏差。我国标准“农作物中农药残留试验准则（NY/T 788—2018）”中规定，添加水平在0.01、0.10 和3.0 mg/kg 时，回收率应分别在60%～120%、70%～120%和70%～110%，相对标准偏差分别在30%、20%和10%以内。本实验在测试的3个浓度水平，丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3种杀菌剂的添加回收率和相对标准偏差均满足要求。

表3 三种杀菌剂在香蕉不同基质中中的添加回收率及相对标准偏差（n=5）

2.2 香蕉不同基质中3种杀菌剂的稳定性

香蕉全果、果肉和果皮中，0.1 mg/kg 三种杀菌剂在冷冻储藏下的稳定性实验结果见图1。丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3种杀菌剂在香蕉不同基质中120 d 内均保持很好的稳定性。在120 d 后，3种杀菌剂的稳定性各不相同，其中丙环唑在360 d时，在香蕉全果、果肉和果皮中均能保持很好的储藏稳定性。戊唑醇和苯醚甲环唑在果皮中储藏360 d 也能保持很好的稳定性，但是在全果和果肉中储藏180 和360 d 后，均存在一定的降解，其中果肉中残留量最低，分别降低至83%和76%。说明3 种杀菌剂在香蕉果皮中最容易保持稳定，其次为香蕉全果，在香蕉果肉中更容易降解。

2.3 不同浓度的3种杀菌剂在香蕉中的稳定性

实验分别测试了0.1 和3.0 mg/kg 两种不同浓度的丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3种杀菌剂在香蕉不同基质中的稳定性，结果见图2。从图2 可以看出，3 种杀菌剂在3.0 mg/kg 储藏浓度时，丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3 种杀菌剂在储藏360 d以后，其在全果、果肉和果皮3种样品基质中的浓度均能稳定在90%以上。在0.1 mg/kg储藏浓度时，丙环唑在全果、果肉和果皮3种样品基质中的浓度也能稳定在90%以上；戊唑醇和苯醚甲环唑在香蕉果皮中浓度稳定在95%以上，但是戊唑醇和苯醚甲环唑在全果和果肉中储藏360 d 后，其浓度出现下降。说明丙环唑在实验的低浓度和高浓度时均能保持较好的稳定性，戊唑醇和苯醚甲环唑在实验的高浓度时也保持较好的稳定性，但是在低浓度时长时间储藏可能会降解。

3 讨论与结论

3.1 农药溶解度的影响

农药在农产品储藏中的降解受环境的温度、湿度，农药本身的物理化学性质，样品基质性质包括样品基质的含水量、基质的pH 值以及其所含的微生物、有机质成分等影响［15］。有研究报道，农药的稳定性与其水溶性相关［16］，本实验结果表明，丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑在高浓度时均能稳定储藏360 d 以上，但是在低浓度时，戊唑醇和苯醚甲环唑均存在一定的降解，其可能与3种杀菌剂的溶解度相关。

图1 0.1 mg/kg三种杀菌剂在香蕉不同基质中的稳定性结果

3.2 样品含水量的影响

样品的含水量是影响农药稳定性的另一重要因素［17］，实验测试了香蕉全果、果肉和果皮3 种基质的含水量，分别为70%～80%、60%～70%和85%～90%。结果表明，3 种杀菌剂的降解速率与含水量差异无显著相关性。有文献报道生物代谢是影响苯醚甲环唑在芒果中降解的主要因素［18］，香蕉营养成分丰富，为生物代谢降解农药提供了物质基础。香蕉果肉中的营养物质明显高于香蕉果皮［19-20］，可能导致丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3种杀菌剂在果皮中稳定性最好，在果肉中降解中速度较快。

图2 不同浓度的3种杀菌剂在香蕉不同基质中的稳定性结果

3.3 样品中农药残留浓度的影响

我国农业行业标准明确规定农药残留储藏稳定性实验的添加水平至少应达到各组分定量限的10 倍［21］，同时，我国食品安全国家标准中规定丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑在香蕉中的最大残留限量分别为1、3和1 mg/kg［22］。因此，本实验设置了0.1 mg/kg 的低浓度，同时设置高浓度3 mg/kg。结果表明，3 种杀菌剂在低浓度和高浓度时冷冻储藏均能保持较好的稳定性，丙环唑在2种浓度是稳定性差异不显著，但是戊唑醇和苯醚甲环唑在低浓度储藏120 d 后下降速度加快，与高浓度差异显著。这说明低浓度时残留浓度容易受降解速率的影响，建议在样品分析时应尽快测定，避免浓度过低出现较大的变化。

本研究结果表明，丙环唑、戊唑醇和苯醚甲环唑3种杀菌剂在香蕉全果、果肉和果皮中有较好的冷冻储藏稳定性。在储藏360 d 以后，在全果、果肉和果皮3 种样品基质中的浓度均能稳定在90%以上。而在3 种不同的香蕉基质之间，3 杀菌剂在香蕉果皮中最容易保持稳定，其次为香蕉全果，在香蕉果肉中更容易降解。