鸡毒支原体与鸡安卡拉病毒混合感染病例的实验室诊断

李 梅，杨 鹏，岳 筠，宋 春，成虹松，陈 静 ，尹德晶，张双翔*，程振涛*，李凤龙

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008；3. 遵义市红花岗区海龙镇农业服务中心，贵州 遵义 563000)

2020年10月，贵州省铜仁市某蛋鸡场鸡群出现零星死亡，几天后死亡数量急剧增加，在7天内死亡1 000余只，死亡率达21%。经调查，该场发病蛋鸡主要为11月龄；剖检病死鸡可见心包内充满淡黄色液体，肝脏充血肿大，喉头出血。为了查明病因，特进行实验室病原学检测诊断，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 检测病料无菌采集该场3只病死鸡的心脏、肝脏、脾脏、气管、脑组织作为检测病料。

1.2 主要试剂新城疫病毒(NDV)实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测试剂盒、禽流感病毒(AIV)通用型实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)；2×TaqPCR MasterMix(购自天根生化科技有限公司)；DNA/RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker(购自大连宝生物工程有限公司)；鲜血琼脂培养基(自制)；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器实时荧光定量PCR仪(bio-rad CFX connect，购自美国bio-rad公司)、多功能梯度PCR仪(VeritiTM96-Well Thermal Cycler，购自ABI公司)。

1.4 细菌分离培养无菌条件下取采集的肝脏、心脏、脾脏组织样品(鲜样)，分别划线接种鲜血琼脂培养基，37 ℃培养24 h后观察结果。

1.5 组织样品DNA/RNA提取分别取3只鸡的心脏、肝脏、脾脏、气管、脑组织病料各1 g于灭菌研钵中，加入生理盐水1.5 mL快速研磨，匀浆后转入1.5 mL灭菌离心管中，8 000 r/min离心2 min，取上清液100 μL，用DNA/RNA试剂盒按说明书方法于室温环境提取总DNA/RNA。

1.6 相关病原核酸检测

1.6.1 NDV核酸检测以提取的总RNA为模板，构建 qRT-PCR反应体系20 μL：无菌无核酸酶水2.6 μL，qRT-PCR反应液10 μL，酶混合液0.4 μL，荧光探针2.0 μL，模板RNA 5 μL。反应条件：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在循环第2步(60 ℃ 35 s)收集荧光，共40个循环。根据试验成立标准，以阳性对照Cq值≤30并出现特定的扩增曲线，且阴性对照无Cq值作为实验成立判断标准。

1.6.2 AIV核酸检测以提取的总RNA为模板，构建 qRT-PCR反应体系20 μL： 无菌无核酸酶水2.8 μL，qRT-PCR反应液10 μL，酶混合液0.4 μL，荧光探针1.8 μL，模板RNA 5 μL。反应条件：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在循环第2步(60 ℃ 35 s)收集荧光，共40个循环。根据试验成立标准，以阳性对照Cq值≤30并出现特定的扩增曲线，且阴性对照无Cq值作为实验成立判断标准。

1.6.3 鸡安卡拉病毒(FAdV-4)核酸检测以提取的总DNA为模板，构建PCR反应体系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL。引物序列：FAdV-4-F：5’-CCCAAGCTTATGTCGGCCCTA ATCGCCT-3’；FAdV-4-R：5’-TGCTCTAGAGGC CAAAGTATCGTCATCGATGAGCAG-3’；Tm值61 ℃。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取PCR产物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶中电泳(110 V 30 min)，凝胶成像仪上观察结果(预扩增片段366 bp)。

1.7 鸡毒支原体(MG)核酸检测以提取的总DNA为模板，构建PCR反应体系25 μL：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：MG-F：5’-ATG AAAGCTAGTATCTATAAA-3’；MG-R：5’-TTATCTT TGGTTGTTAAATTCAG-3’；Tm值56 ℃。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物8 μL于含核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶上电泳(110 V 30 min)，于凝胶成像系统观察结果(预扩增片段639 bp)。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果3只病死鸡组织样品在鲜血琼脂培养基中均无菌落生长，表明无细菌感染。

2.2 相关病原核酸检测结果

2.2.1 NDV核酸检测由图1可见：阳性对照Cq值为25，3个检测样品均无明显扩增曲线和Cq值，提示组织样品中不存在NDV感染。

+：阳性对照； -：阴性对照； 1～3：检测样品图1 NDV qRT-PCR检测结果

2.2.2 AIV核酸检测由图2可见：阳性对照Cq值为27，而3个检测样品Cq值均为0，且无明显扩增曲线，提示组织样品中不存在AIV感染。

+：阳性对照； -：阴性对照； 1～3：检测样品图2 AIV qRT-PCR检测结果

2.2.3 FAdV-4核酸检测由图3可见：3个检测样品PCR均扩增出366 bp目的基因片段，与阳性对照相符，提示组织样品中存在FAdV-4感染。

M：2 000 bp分子质量标准； -：阴性对照； 1～3：检测样品； +：阳性对照图3 FAdV-4 PCR检测结果

2.3 MG核酸检测由图4可见：3个检测样品中有1个样品PCR扩增出639 bp目的基因片段，与阳性对照相符，提示1 个组织样品中存在MG感染。另外2个样品中无MG感染。

M：2 000 bp分子质量标准； -：阴性对照； 1～3：检测样品； +：阳性对照图4 MG PCR检测结果

3 结论

通过对3只病死鸡采集病料进行细菌分离鉴定和相关病原核酸检测，确诊该蛋鸡场病例存在鸡毒支原体与鸡安卡拉病毒混合感染。建议该蛋鸡养殖场用抗病毒药物联合抗支原体药物控制疫情，并做好相关无害化处理及净化工作。

4 讨论

近年来，贵州省蛋鸡产业在相关政策的大力扶持下得以迅速发展，但由于发展过程中饲养管理、生产技术、疫病防控、环境污染等问题，致使蛋鸡疫病不断发生且多种疫病混合感染日趋严重。常见的病原有禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、安卡拉病毒(FAdV-4)，鸡毒支原体(MG)、滑液囊支原体(MS)等[1，2]。鸡毒支原体病是由MG引起的1种慢性呼吸道传染病，以发生呼吸道症状为主，病程长，病死率低，但可致幼鸡生长缓慢，蛋鸡产蛋下降，给养鸡业造成严重经济损失[3，4]。鸡安卡拉病是由禽腺病毒Ⅰ 群 C种血清4型(FAdV-4)引起的以心包积液、肝脏肿大出血为主要特征的疾病，又称心包积液-肝炎综合症[5]。2015年以来，全国各地关于鸡心包积水综合征(安卡拉病)的病例报道陆续增多，传染性强，死亡率高，给养殖户造成很大损失[6]。本次检测也证实该病在我省存在，且为在蛋鸡群中发生。此外本次检测结果还表明蛋鸡群存在鸡毒支原体混合感染，需要加强该病的净化工作。对于发生混合感染的鸡群，临床症状与病理变化复杂，因此鸡场在发病初期就应迅速送检，通过实验室检测诊断尽快确诊病因，对症对因正确处理，以免延误病情造成更大的损失。