维生素B12对皮肤损伤创面干预实验研究

赵悦辰,杨小玉,杜昊睿,王铁君*,王嘉鹏,夏雪怡

(1.吉林大学第二医院 放疗科，吉林 长春130041;2.吉林大学第二医院 骨科，吉林 长春130041;3.吉林省一汽总医院 骨科，吉林 长春130011;4.吉林大学第二医院 眼科手术室，吉林 长春130041)

皮肤是人体最大的器官，具有免疫监视、损伤防御及调节体液平衡等多种生理功能，是人体与外界环境之间天然保护屏障。在外伤、手术等因素作用下，皮肤及其深部组织受到机械性损伤会导致皮肤缺损及功能丧失，从而引起外界细菌、真菌、病毒等微生物通过创伤部位进入机体，造成创伤感染，甚至败血症等全身感染[1-2]。正常情况下，在皮肤屏障被破坏后,机体会调动免疫细胞、干细胞、成纤维细胞等对皮肤缺损处进行修复，但在修复程中,如果各种因素不能得到有效协调,则会发生迁延不愈等情况。因此，如何采取有效措施促进创伤修复、减少疤痕形成一直是皮肤损伤治疗中的重中之重。维生素B12是一种重要的生物活性物质，是细胞合成核酸过程中的重要辅酶，能够催化分子重排、核苷酸生成脱氧核苷酸、转甲基等反应。同时，维生素B12又是RNA合成不可缺少的物质，能够加快肉芽组织增生及上皮细胞增殖，对受损皮肤黏膜上皮细胞及血管内皮细胞具有较强的修复再生功能，对受损的神经鞘具有营养和促进修复作用[3-4]。目前维生素B12主要应用于治疗恶性贫血、神经炎、神经萎缩等疾病。近年来研究发现，维生素B12对创伤、放射性皮肤损伤等也具有一定作用，但其具体治疗效果未深入研究。因此本研究利用小型香猪全皮层损伤作为动物模型，通过维生素B12软膏对创伤进行治疗，研究维生素B12软膏对皮肤创伤的修复作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

小型香猪3只，6-7月龄，体重15±2 kg，雌雄不限。饲养于吉林大学基础医学院动物实验中心标准动物室(22℃)。自然照明条件下，实验动物自由摄食、饮水。

1.2 皮肤创伤模型建立及干预方法

在实验前1天，剔除香猪背部位毛发。以3%戊巴比妥钠静脉注射进行麻醉，随后利用75%乙醇对背部位皮肤进行消毒，采用直径25 mm的取皮器并排在实验动物背部制备3个直径为25 mm的圆形创面，深达皮下组织全层，勿伤及皮下筋膜层。实验动物背部单侧从头至尾3个创面依次设为Control组，三乙醇胺组，维生素B12组。维生素B12软膏组每日涂抹复方维生素B12软膏Ⅱ号(主要成为维生素B12，硫酸庆大霉素)进行药物干预，三乙醇胺组每日在创口涂抹比亚芬烫伤膏(法国Biafine Act)进行药物干预，Control组不作任何涂抹。

1.3 创口观察及愈合率计算

在皮肤创伤模型建立后，于0、5、9、13、21、25及29天，用数码相机拍摄皮肤伤口照片，同时利用Image-pro plus 6.0软件对图片进行处理，测量创口面积及创口愈合率，创口愈合率按如下公式计算：创口愈合率=[(A0-At)/A0]×100%，其中A0表示创面初始面积(t=0)，At表示不同时间点实验动物的背部创口面积。

1.4 标本取材及组织学分析

术后29天，处死实验动物并取下创口皮肤样本，用切割器仔细修剪。新鲜组织块样本在4%多聚甲醛固定24 h以上，对组织进行依次梯度酒精脱水及石蜡包埋处理。利用石蜡切片机将组织切成厚度为4 μm的薄片。随后对组织切片进行HE染色、Masson染色，并在正置光学显微镜下观察组织样本结构变化。

1.5 透射电子显微镜分析

在4℃条件下，利用4%戊二醛0.1 M磷酸盐缓冲液对皮肤组织样本固定2-4 h，随后组织标本在1%四氧化锇溶液中继续固定2-4 h。通过醋酸铀酰水溶液对组织样本染色1 h，随后醇类逐级脱水并将组织样本用包埋剂包埋。将处理后组织块切割成0.5-1.0 μm厚的薄片，依次通过甲苯胺蓝、醋酸铀和枸橼酸铅对组织片进行染色，染色时间为15 min，室温干燥过夜。最后在透射电子显微镜下观察组织标本的超微结构。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 皮肤创口外相及创口愈合率

为了对不同实验组小型香猪表皮创口愈合情况进行分析，我们分别于不同时间点对皮肤创口进行观察并使用Image-pro plus 6.0软件对愈合率进行测量。如图1、2所示，术后第13天之前，各组实验动物造模处均可见明显缺损，皮肤愈合较为缓慢。从第17天开始，与Control组相比，三乙醇胺组和维生素B12组表皮创口明显减小，愈合率显著提升。随着时间的推移，三乙醇胺组和维生素B12组继续保持这种良好的修复效果。术后29天后，在所有组中，Control组创口愈合情况最差，创口表面存在大面积缺损，创面愈合仅约50%。与Control相比，维生素B12组、三乙醇胺组创口愈合率显著提高(P<0.05)。维生素B12组创口已接近完全愈合，愈合率高达93.5%，创面基本完全被新生皮肤组织所取代。相比于维生素B12组，三乙醇胺组创口治疗效果略差，创口愈合率为87%，创口部位仍有少许瘢痕存在。最后我们应用Image-pro plus 6.0软件测量术后29天各组实验动物的相对创口宽度。结果显示(图3)，与Control组相比，三乙醇胺组相对创口宽度无显著差异(P>0.05)，维生素B12组相对创口宽度显著减小(P<0.05)。

图1 不同时间点各组实验动物表皮创伤外相

图2 各实验组表皮愈合曲线

图3 各组实验动物表皮创口相对宽度

2.2 皮肤创伤模型中各组的组织学改变

皮肤创伤的愈合涉及多种细胞、组织及体液因子参与，这一过程主要包括肉芽组织增生、上皮化生及皮肤附属器官的再生。这些组织学的变化可通过HE染色进行观察。如图4所示，在所有实验组中，新生表皮组织均缺少腺体、毛囊等皮肤附属器官。在Control组中可见大量结痂形成，新生组织结构较为疏松。与Control组相比，维生素B12组及三乙醇胺组皮下组织更为致密，证明创伤修复效果更佳。特别是在维生素B12组，细胞外基质有序程度明显优于其他各组，且与原有组织之间并无明显的分界线，证明新生组织融合度更高。在创伤愈合过程中，缺损部位会产生大量胶原纤维以填补缺损部位，Masson染色是评估组织胶原纤维含量的常用手段，如图5所示，新生皮肤组织中胶原纤维被染为蓝色，在Control组及三乙醇胺组中胶原纤维排列较为混乱无序，且含量较少。相比之下，在维生素B12组可见更多胶原纤维形成，并且排列较为有序。因此，通过HE及Masson染色可推测维生素B12软膏能显著促进皮肤组织再生及胶原沉积。

图4 HE染色对创面再生进行组织形态学分析

图5 Masson染色对创面胶原沉积情况进行分析

2.3 透射电镜观察组织的超微结构

为了一进步评测复方维生素B12软膏对皮肤创口愈合的影响，我们通过透射电子显微镜观察各组皮肤组织的超微结构变化。由图6可见各组胶原纤维呈管状结构排列，排列规则程度和胶原纤维间隙大小具有一定差异性。维生素B12组中，可见横向截面胶原纤维间隙较小、排列致密，纵向截面胶原纤维排列较规则。在Control组、三乙醇胺组中，横向截面胶原纤维间隙较大、排列较稀疏，纵向截面胶原纤维排列规则程度也略低于维生素B12组。通过透射电镜结果证明维生素B12软膏表皮修复效果最好，新生皮肤中胶原纤维排列分布更为有序，接近于正常皮肤组织。

图6 各组实验动物表皮组织的透射电镜照片

3 讨论

皮肤作为人体最大的器官，在维持体液平衡和保护内脏免受外界损伤方面有重要作用。烧伤、烫伤、撕裂和手术造成的皮肤创伤是全世界最重要的健康问题之一，可发生在身体的各个部位。严重的皮肤创伤往往伴有创面部位的感染，会阻碍创面的正常愈合并导致更严重的循环症状，严重者甚至可能死亡[5-7]。因此，如何有效缓解皮肤创伤患者症状并提高创伤修复率成为目前亟待解决的重要问题。在皮肤创伤治疗中，局部药物治疗应用最为广泛，对机体副作用较小，并且创口部位药物浓度高[8]。目前应用于皮肤创伤局部治疗的药物种类很多，如维生素、三乙醇胺、类固醇乳膏等，这些药物在疗效上存在一定的差异，目前尚无标准的治疗方案。

本研究中应用复方维生素B12软膏Ⅱ号对皮肤创伤进行治疗并评测其临床应用价值。这种维生素B12软膏的作用为止痒镇痛、抗菌及修复血管内皮细胞损伤,是当前治疗皮肤、粘膜损伤的有效药物之一。在维生素B12软膏中的庆大霉素成分是氨基糖苷类抗菌药物的一种，具有广谱的抗菌效果，能够有效抑制绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌等致病菌的生长，尤其对于革兰氏阴性菌具有极强的杀伤效果，可防止皮肤创口感染的发生，提高皮肤创口愈合率[9]。此外，相对于其他抗菌药物，庆大霉素不会使致病菌产生较强的耐药性。而维生素B12又称为氰钴胺，其对机体组织蛋白及脂类的合成及代谢具有重要作用[10]。体内维生素B12代谢水平的改变可能会导致白癜风、口腔炎、特应性皮炎、痤疮等皮肤疾病的发生[11-12]。在皮肤吸收维生素B12后，皮肤中RNA合成速率有效增强，加速损伤部位皮肤粘膜及血管的再生。此外，维生素B12可降低皮肤敏感性，抑制组织增生反应，还具有止痒镇痛及预防血管痉挛的作用[13]。本研究成功建立了小型香猪皮肤创伤模型，利用复方维生素B12软膏对皮肤创口进行治疗，同时与一种临床常用的皮肤创伤治疗药物三乙醇胺进行疗效对比。表皮创伤外相及愈合率评分显示利用维生素B12软膏对皮肤创口进行治疗后，创口表皮愈合率明显高于三乙醇胺治疗组，维生素B12软膏有效促进了表皮损伤后组织再生的愈合速率。通过组织学观察，维生素B12组创面新生部位较为平整，组织排列有序，并且有大量胶原沉积。相比于其他各组，维生素B12组新生组织表面结构接近于正常皮肤，愈合程度明显优于三乙醇胺组。

综上所述，维生素B12软膏能够加速皮肤创伤的愈合速率，有效促进皮肤组织的再生及胶原沉积，在皮肤创伤临床治疗中具有有巨大的应用前景。