东北绵羊股骨骨密质组织形态学特征的研究

辛 阳，辛彩蕊，孔 超，林子清通信作者

(1.中国刑事警察学院法医学系，辽宁 沈阳 110035；2.西藏警官专科学校科研所，西藏 拉萨 850000)

0 引言

绵羊(domestic sheep，Ovis aries)因被人类驯化彻底，并可为人类社会提供大量的羊毛纤维、肉、奶制品，成为了世界上最主要的经济动物之一。但对它的研究主要集中在经济和畜牧业领域，对其骨组织学的研究很少，仅有张继宗等对部分骨组织形态特征进行过简单描述[1-2]。本文对绵羊的股骨骨密质组织切片制作条件进行了探索，并对其组织学形态特征进行了系统研究，其不仅可以为法医学和考古学在微观水平的种属鉴别提供科学手段，还可以为绵羊的生物进化提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 材料

身体健康，骨骼健壮的成年绵羊(2～2.5岁) 50只，雌雄不限，体重20～50 kg，采取全身麻醉、颈动脉放血处死后，取其右后肢股骨中段备检。处死的方法符合动物实验的伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 固定

取前述绵羊股骨中段，用钢锯锯成厚3～5 mm的薄片，放入装有10%福尔马林溶液的容器中，室温(20℃左右)放置3～5 d。

1.2.2 脱钙

按照Murayama法和Alexander法分别配制甲酸脱钙液和硝酸脱钙液[3]，将同一个体的上述骨片分别放入2种溶液中，更换脱钙液1次/d，第3、4、5、6、7、8、9、10天分别用脱钙终点确定液滴定，检验脱钙液中钙质含量，确定骨质脱钙程度，探索甲酸脱钙和硝酸脱钙2种方法的效果和所需时间。

1.2.3 包埋及切片

将脱钙后的骨薄片流水冲洗24 h，用冷冻组织包埋剂(OCT)包埋后，放入冷冻切片机(英国BROTHER公司)冷冻室内冷冻3～5 min，用切片机切成20 μm厚的薄片，放入无水乙醇中备用。

1.2.4 染色封片

将切好后放在无水乙醇中备用的骨切片放入事先按常规配制好的硫瑾/苦味酸染色液中，室温放置12～20 min，然后放入苦味酸染色液中分别染色30 s、45 s和60 s，用70%和95%乙醇分色后观察染色效果待封片。然后用二甲苯-石碳酸和纯二甲苯溶液各透明3 min后，即可用中性合成树胶封片[4]。

1.2.5 切片观察指标及统计学分析

采用Nikon ECLIPSE 80i病理图像处理系统×200镜下观察哈氏系统的数量、形态、直径、排列及面积，间骨板的数量、形态、排列、面积百分比、环层骨板形态，内、外环骨板的厚度及相对厚度，非哈氏管的数量。×400镜下观察哈氏系统环层骨板数，哈氏管直径及面积，间骨板环层骨板数，骨陷窝数量、排列和面积。所有观察数据利用SPSS软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 骨单位

绵羊股骨的骨单位多呈圆形或椭圆形，与间骨板之间界限清晰，排列多无规律。哈氏系统环层骨板分层较清晰，中央管呈圆、椭圆型或串联的长条形等。骨单位整体排列有一定的走向性，在第二代骨单位中常夹杂比较孤立、圆形、并且体积稍大、边界清晰的骨单位。骨单位数量:在200×镜下一个视野内3～18个，平均7.59个。骨单位直径:90～300 μm，平均175.16 μm。骨单位面积平均为16 662.73 μm2。哈氏管直径:11～100 μm，平均30.16 μm。哈氏管面积平均为605.20 μm2。哈氏系统环层骨板数5～27个，平均12.86个。骨细胞多为短梭形或椭圆型。

2.2 间骨板

间骨板又称旧骨单位，是第一代骨单位被第二代骨单位破坏后残留的不完整骨单位。200×镜下绵羊股骨中段的间骨板数量平均数为1.85，最多者为每个视野5个，最少者为每个视野0个。排列不规则，无规律性，大小不等，形状近似于半弧形。间骨板的环层骨板排列比较整齐，其骨陷窝有层状排列的趋势，大小不均。

2.3 内、外环骨板

股骨外环骨板多数(80%)有完整的外环骨板，形态多呈连续状态，外环骨板厚薄不等，平均厚度为145.97 μm，外环骨板的平均相对厚度为0.097 31 μm。

内环骨板的平均厚度为130.11 μm，内环骨板的平均相对厚度为0.081 975 μm。内环骨板厚薄不均，有骨单位的部分内环骨板不连续，如图1所示。

图1 内环骨板×200

2.4 非哈氏管的数量

200×显微镜下绵羊股骨中段的非哈氏管数量平均数为2.08。最多者每个视野中6个，最少者每个视野中0个。排列不规则，无规律性，大小不等，形状不一。

2.5 骨陷窝

绵羊股骨的骨陷窝数量较多，在400×镜下一个视野内49～119个，平均为69.30个；绝大部分呈梭形、椭圆形、近圆形，不规则形，有层状排列的趋势，骨陷窝大小不均。最大者为 78.1 μm，最小者为13.1 μm，平均为30.37 μm。偶见骨陷窝周围较多的呈放射状排列的骨小管，如图2所示。

图2 骨陷窝×200

2.6 骨小梁

绵羊股骨中段50张切片中，偶见骨小梁。

2.7 丛状骨

200×镜下绵羊股骨中段典型丛状股偶见，个体差异性大，排列不规则，无规律性，大小不等，形状多近似彩虹状，其骨陷窝有层状排列的趋势，大小不均。

2.8 骨单位带

绵羊股骨中段在200×镜下骨单位带数量为0～3个，平均1.61个，其结构近似于骨单位，形状多为椭圆形，中央管多数为2个，其股陷窝呈层状排列，大小不均。

3 讨论

3.1 骨切片制作及染色条件的分析

骨组织是一种坚硬的结缔组织，含有大量固定的无机盐，而无机盐又是以羟基磷灰石结晶的形式存在，其中大部分为水合磷酸钙[5]。因此，在骨组织切片制作过程中，从取材、组织处理、切片到染色等方面的要求都非常高，其中每一环节都会直接影响到组织制片的质量。首先骨组织取材不可太厚太大，厚薄不均，凹凸不平或太薄太碎。取材太厚，脱钙液对它的穿透力必然受阻，而厚薄不均及凹凸不平则使组织在脱钙过程中形成脱钙不均匀现象，使组织中的钙盐部分脱尽，部分未脱尽，从而影响到后续步骤[6]。其次强酸脱钙法虽然脱钙速度较快，但由于其酸性过强，会导致组织结构破坏，时间过长将影响染色效果，因此应随时观察，检测不出钙质成分时则应立即终止脱钙。弱酸脱钙法脱钙时间较长，脱钙不完全切片时会感到阻力大，切片易碎、易裂、易产生皱折。

硫堇染色时间不确定，一般把切片染为棕黄色。因温度、切片厚度、染色液使用次数等因素对硫堇染色的影响很大，所以硫堇染色时间不固定，要随时观察染色程度。经对苦味酸 30 s、45 s和50 s染色效果的比较，发现染色时间为45 s的效果最好，因而确定其时间为45 s。经乙醇脱水，二甲苯透明等步骤后，骨陷窝、骨小管呈棕黑色，骨基质为淡黄至棕黄色，结构比较清晰。

3.2 骨组织特征分析

绵羊股骨个体差异比较大，不论是骨单位的200×显微镜下同一视野下的个数，还是其大小、面积以及骨陷窝的面积个体间都存在明显的差异，在同一个体数据也会存在明显差异，出现两种结构特点:在50只东北绵羊股骨切片中，大多数骨单位与间骨板分界清晰，骨单位呈椭圆和近圆形，排列多无规律。哈氏系统环层骨板分层比较清晰，哈氏系统环层骨板层数也较多，且相对比较恒定，骨细胞主要以呈层状排列的梭形或椭圆形式存在，间骨板也比较常见，丛状骨也可见到，但数量相对较少。少部分标本切片骨单位与间骨板分界不清晰，骨单位数量较多，形态近似椭圆形，哈氏系统环层骨板分层不明显，骨单位整体排列有一定的走向性。但在总体上看东北绵羊股骨切片有其共同特点和规律:东北绵羊的股骨骨密质内、外环骨板与骨单位，间骨板分界比较清楚，内、外环骨板分层比较明显，其形态多呈连续状态，骨陷窝数量较多，且数量相对比较恒定。非哈弗系统，骨单位带比较常见。

本研究的结果不仅可以为法医学和考古学等领域提供微观水平的种属鉴别方法，还可以微动物骨组织形态的进化提供基础数据。