长度和化学修饰在多壁碳纳米管诱导内皮细胞活化中的作用

申 杰，杨 迪，陈梦圆，郭新彪

(北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，北京 100191)

内皮细胞(endothelial cells，ECs)是MWCNTs进入血液输送至靶器官之前需要接触的细胞[6]。生理条件下，ECs参与调节代谢平衡、血管血流动力学、血管通透性、凝血和细胞募集。内皮细胞活化是指内皮细胞对环境刺激发生的细胞表型或功能的改变，最显著的特征是内皮细胞-白细胞相互作用的增加，该活化过程还包括趋化因子和细胞表面黏附因子的表达上调[7]。内皮细胞活化在缺血再灌注损伤、血栓形成以及动脉粥样硬化等疾病的发生和发展中发挥重要作用[8]。探讨MWCNTs对内皮细胞活化的作用规律及其机制，评估MWCNTs暴露对ECs的毒性以及改善MWCNTs的生物相容性有重要意义。

炎性小体是胞浆中激活半胱氨酰天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate-specific proteases caspase)-1的多聚蛋白复合物,核苷酸结合寡聚结构域样受体家族含pyrin结构域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎性小体是目前研究最深入和最具特征的炎性小体[9]，它可识别多种病原信号并诱导炎症反应。动物和体外实验表明，NLRP3炎性小体的激活参与内皮细胞活化[10-11],然而现有研究尚缺少MWCNTs激活ECs内NLRP3炎性小体的相关证据，不同长度和化学修饰的MWCNTs对ECs内NLRP3炎性小体的激活作用也尚未见报道。本研究旨在比较不同长度和化学修饰的MWCNTs对内皮细胞活化的作用并探讨NLRP3炎性小体相关机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

杜氏培养液(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、RPMI 1640 培养液、L-谷氨酰胺、青链霉素均购自美国Sigma-Aldrich公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自德国PAN-Biotech公司，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)均购自北京索莱宝科技有限公司；乳酸脱氢酶检测试剂盒、细胞增殖检测(cell counting kit，CCK)-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，小鼠血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，活细胞示踪剂 CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)购自上海翊圣生物科技有限公司，GAPDH抗体、NLRP3抗体购自英国Abcam公司，山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，磷酸化蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司，考马斯亮蓝法蛋白质定量试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.2 MWCNTs的理化表征及染毒液制备

研究使用的MWCNTs分别为未修饰的短MWCNT(short MWCNT，S-MWCNT)、未修饰的长MWCNT(long MWCNT，L-MWCNT)、羧基修饰的长MWCNT(long carboxyl-functionalized MWCNT，L-MWCNTs-COOH)、羟基修饰的长MWCNT(long hydroxyl-functionalized MWCNT，L-MWCNT-OH)和氨基修饰的长MWCNT(long amino-functionalized MWCNT，L-MWCNT-NH2)均购自中国科学院成都有机化学有限公司，采用化学气相沉积法(chemical vapor deposition，CVD)合成。产品说明中MWCNTs的基本特征信息见表1。

表1 厂家提供的MWCNTs理化性质信息Table 1 The physicochemical information of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) provided by the manufacturer

为进一步表征MWCNTs，前期研究采用透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM，JEM-1400 Plus，日本JEOL公司)对MWCNTs的形态和粒径进行观察，具体方法和结果参考本课题组前期研究[12-13]。本研究应用动态光散射粒度分析仪(dynamic light scattering and Zetasizer，Zetasizer nano ZS，英国Malvern公司)对MWCNTs在DMEM(含质量分数2% FBS)培养液中的分散状态、平均水化粒径及Zeta电位进行表征。

将MWCNTs粉末以1 g/L的浓度分散在含1%(质量分数)BSA的PBS溶液中，在冰水中超声分散3 h得到储备液，4 ℃保存备用。每次使用前，将储备液超声处理5 min，然后在含有2%(质量分数) FBS的培养液中稀释至最终染毒浓度。

1.3 小鼠脑微血管内皮细胞株b.End3和人外周血单核细胞株THP-1培养

本研究使用的细胞模型为小鼠脑血管内皮细胞株b.End3和人外周血单核细胞株THP-1，均购自美国模式培养菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。b.End3是目前常用的永生化血管内皮细胞系之一，具有纯度高、易获取、易操作、各代细胞间变异小等优点[14]。该细胞系在活化状态下表达较丰富的黏附因子和选择素，常用于内皮细胞活化的相关研究[15]。b.End3细胞在含有10%(质量分数)FBS、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1%(质量分数)青链霉素的DMEM培养液中，于37 ℃、饱和湿度、5%(体积分数)CO2的培养箱中培养，实验测定在 3～20代细胞的对数生长期进行。

人外周血单核细胞系THP-1在含有10% FBS、4 mmol/L L-谷氨酰胺和1% 青链霉素的RPMI1640培养液中，于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养，实验测定在3～20代细胞的对数生长期进行。

第四，要锤炼高尚的品格和坚韧不拔的耐力。一个国家、一个民族，没有一种精神力量，就形不成很强的凝聚力。习近平总书记说：“中华民族伟大复兴，绝不是轻轻松松、敲锣打鼓就能实现的。全党必须准备付出更为艰巨、更为艰苦的努力。”中华民族的复兴，是一个很长的过程，要注重培养一种积极的生活态度，展示良好的精神风貌，使平凡者变得伟大，平庸者摆脱平庸。古往今来，无数商业巨子、政坛领袖、文学大师，都是饱经风雨，以顽强的毅力，在风浪中搏击。我们要敢于直面困难、直面挑战、坚韧不拔、百折不挠，一步一个脚印，全力写好人生的答卷。

1.4 细胞毒性测定

采用CCK-8和LDH释放试剂盒测定细胞毒性，b.End3细胞暴露于不同浓度的MWCNTs(0～125 μg/cm2)24 h后，进行CCK-8检测，细胞上清液15 000 ×g，离心30 min后用于LDH释放测定。使用多功能酶标仪(Varioskan Flash,美国赛默飞世尔科技公司)在450 nm(用于CCK-8)或490 nm(用于LDH释放试验)测定光密度。

1.5 ELISA测定细胞上清中可溶性VCAM-1含量

使用小鼠VCAM-1酶联免疫试剂盒测定MWCNTs染毒后的细胞上清中可溶性VCAM-1(soluble VCAM-1，sVCAM-1)含量，使用多功能酶标仪在450 nm处测定光密度，根据标准系列测定的D值绘制标准曲线，并根据样本D值和标准曲线计算样本浓度。

1.6 单核细胞-内皮细胞黏附试验

通过活细胞示踪剂 CMFDA(cell tracker green 5-chloromethylfluorescein diacetate)标记THP-1单核细胞，并将标记好的THP-1与暴露MWCNTs后的b.End3在正常生长条件下孵育1 h，孵育完毕，使用PBS冲洗b.End3细胞3次，将未黏附在b.End3细胞上的THP-1去除。采用倒置荧光显微镜观察黏附在b.End3细胞上的THP-1(绿色荧光标记)，每组选取10个视野拍摄并保存图片，使用Image J软件计算每张图片中荧光THP-1细胞个数。

1.7 Western blot

b.End3细胞暴露于6.25 μg/cm2的MWCNTs不同时间(4、12和24 h)后，使用磷酸化蛋白提取试剂盒提取蛋白质,使用考马斯亮蓝蛋白定量法对提取蛋白定量。以50 μg蛋白/槽上样至10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，40 mA恒流电泳1.5 h；然后250 mA 2.5 h将蛋白转移至PVDF膜上。将膜在含5%(质量分数)BSA的TBST中室温封闭2 h后，4 ℃孵育一抗(NLRP3抗体)1∶300、GAPDH抗体(内参)1∶1 000过夜。然后与山羊抗兔或山羊抗鼠-HRP标记二抗(1∶2 000)室温孵育2 h。使用化学发光图像分析系统(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)检测蛋白条带并拍照，使用Image J软件分析蛋白条带。

1.8 统计学分析

每个实验重复2～3次，计量资料以均数±标准差表示，使用Graphpad prism7软件对数据进行统计学分析和作图。采用Studentt检验进行两组间的比较，单因素方差分析进行多组间的比较；若有差异，则采用Turkey’s检验进行组间两两比较。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MWCNTs的理化表征

根据厂家提供的信息(表1)，所有类型碳管的纯度均>98%，且具有相似的外径。使用动态光散射仪对分散在细胞培养液DMEM(含2%FBS)中的MWCNTs进行了表征，MWCNTs的平均水化粒径为80～250 nm(表2)，多分散系数(polydispersity，PDI)为0.248～0.310，各组的Zeta电位均为负，且绝对值相差不大，均在10左右，提示各组碳管在培养液中分散状况均良好。

表2 MWCNTs的理化性质Table 2 Physicochemical characterization of the multi-walled carbon nanotubes (MWCNT)

2.2 MWCNTs对b.End3的细胞毒性

采用CCK-8和LDH测定MWCNTs对内皮细胞b.End3增殖活性和细胞膜完整性的影响，为后续试验测定提供剂量设置依据。随着染毒剂量的增加，所有类型的MWCNTs均会引起b.End3的细胞活性降低，细胞膜完整性受损，LDH释放增加(图1)。在125 μg/cm2的浓度下，所有类型的MWCNTs作用24 h后均诱导b.End3细胞活性显著降低，LDH释放显著增加，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。在较高浓度62.5 μg/cm2下，亦可观察到部分碳纳米管对b.End3细胞活性和LDH释放的影响。相同浓度下，未观察到各MWCNTs处理组对细胞增殖活性影响的显著差异。在125 μg/cm2的浓度下，L-MWCNT作用后的细胞LDH释放显著高于S-MWCNT组(P<0.01)，也高于L-MWCNT-COOH、L-MWCNT-OH和L-MWCNT-NH2处理组(P<0.01)；在62.5 μg/cm2的浓度下，S-MWCNT作用后的细胞LDH释放显著低于L-MWCNT处理组(P<0.01)。

Cells were treated with different concentrations of MWCNTs for 24 h,and cell proliferation rate and cell membrane damage were detected by CCK-8 (A) and LDH (B) release assay,respectively.*P<0.05 or △P<0.01 vs. controls.#P<0.05 or ▲P<0.01 vs. L-MWCNT group.图1 MWCNTs对b.End3的细胞毒性Figure 1 Cytotoxicity of MWCNTs in b.End3 cells

2.3 不同长度的MWCNTs对b.End3内皮细胞活化效应的影响

采用ELISA测定碳管染毒后的b.End3细胞上清sVCAM-1水平，并采用细胞黏附试验检测b.End3对单核细胞THP-1的黏附力，共同评价MWCNTs对b.End3对内皮细胞活化的影响(图2)，在6.25 μg/cm2和12.5 μg/cm2的浓度下，两种长度MWCNTs作用b.End3细胞24 h后均诱导细胞上清sVCAM-1水平显著增加，b.End3对THP-1的黏附力显著增强(P<0.05和P<0.01)。在相同浓度下，L-MWCNT处理组的细胞上清sVCAM-1水平及细胞对THP-1的黏附力显著强于S-MWCNT处理组(P<0.05，P<0.01)。

After exposure to different concentrations for 24 h,effects of S-MWCNT and L-MWCNT on the endothelial activation of b.End3 were determined by the measurement of soluble vascular adhesion molecule-1 (sVCAM-1) concentration in cell supernatant (A) and adhesion assay of THP-1 cells to b.End3 (B).*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.# P<0.05,▲P<0.01 vs. S-MWCNT group.图2 不同长度MWCNTs诱导b.End3内皮细胞活化效应比较Figure 2 Comparison of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs of different lengths

2.4 不同化学修饰的MWCNTs对b.End3内皮细胞活化效应的影响

比较相同长度下未修饰，羧基、氨基和羟基修饰的MWCNTs对b.End3内皮细胞活化的影响(图3)，在6.25 μg/cm2和12.5 μg/cm2的浓度下，所有类型的MWCNTs作用b.End3细胞24 h后均诱导细胞上清sVCAM-1水平显著增加，b.End3对THP-1的黏附力显著增强(P<0.01)。而在相同浓度下，不同化学修饰的MWCNTs对内皮细胞活化的影响差异无统计学意义。

After exposure to different concentrations for 24 h,effects of L-MWCNT,L-MWCNT-COOH,L-MWCNT-NH2 and L-MWCNT-OH on the endothelial activation of b.End3 were determined by the measurement of soluble vascular adhesion molecule-1 (sVCAM-1) concentration in cell supernatant (A) and adhesion assay of THP-1 cells to b.End3 (B).△P<0.01 vs.untreated controls.图3 不同化学修饰的MWCNTs诱导b.End3内皮细胞活化效应比较Figure 3 Comparison of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs of different chemical modification

2.5 不同长度和化学修饰的MWCNTs诱导b.End3内皮细胞活化的时效关系

探讨MWCNTs诱导b.End3内皮细胞活化的时效关系(图4A、4B)，6.25 μg/cm2的L-MWCNT和S-MWCNT作用12 h后，b.End3细胞上清sVCAM-1水平显著增加，b.End3对THP-1的黏附力显著增强(P<0.05，P<0.01)，而作用24 h后，上述效应更加明显，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。作用24 h后，L-MWCNTs处理组细胞上清sVCAM-1水平显著高于S-MWCNT处理组(P<0.05和P<0.01)；作用12 h后，L-MWCNTs处理组细胞对THP-1的黏附力显著强于S-MWCNT处理组，差异具有统计学意义(P<0.01)。

对于相同长度下4种不同化学修饰的MWCNTs(图4C、4D)，6.25 μg/cm2的MWCNTs作用12 h后，L-MWCNT、L-MWCNT-COOH和L-MWCNT-OH处理组细胞上清sVCAM-1含量显著增加，4种MWCNTs诱导细胞对 THP-1的黏附力均显著增强(P<0.05，P<0.01)，而作用24 h后，上述效应更加明显，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。在相同的作用时间下，不同化学修饰的MWCNTs对内皮细胞活化的影响差异无统计学意义。

After exposure to 6.25 μg/cm2 MWCNTs for 4 h,12 h or 24 h,time-dependent effects of S-MWCNTs and L-MWCNTs on the endothelial activation of b.End3 were determined (A,B).Similarly,time-dependent effects of L-MWCNT,L-MWCNT-COOH,L-MWCNT-NH2 and L-MWCNT-OH on the endothelial activation were also evaluated (C,D).sVCAM-1,soluble vascular adhesion molecule-1.*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.▲P<0.01 vs. S-MWCNT group.图4 不同长度或化学修饰的MWCNTs诱导b.End3内皮细胞活化的时效关系Figure 4 Time-dependent effects of endothelial activation effects in b.End3 induced by MWCNTs with different length or chemical modification

2.6 MWCNTs的长度和羧基修饰对b.End3细胞NLRP3蛋白表达的影响

由于羧基、羟基或氨基修饰对MWCNTs诱导内皮细胞活化未见明显影响，因此,为进一步探讨MWCNTs诱导内皮细胞活化在长度和修饰形式两个方面产生效应差异的可能机制，选取了S-MWCNT、L-MWCNT、L-MWCNT-COOH 3种碳管，在 6.25 μg/cm2浓度下作用b.End3细胞不同时间后，比较长度和羧基修饰对细胞内NLRP3蛋白表达水平的影响(图5)，3种MWCNTs作用后，细胞内NLRP3蛋白表达水平均表现为随时间增加而增加的趋势。作用24 h后，S-MWCNT诱导细胞NLRP3表达水平显著增加(P<0.05)，而L-MWCNT和L-MWCNT-COOH处理组在作用4 h后观察到细胞中NLRP3表达水平的显著增加并持续至24 h(P<0.05，P<0.01)。作用4 h和12 h时，L-MWCNT处理组细胞NLRP3蛋白表达水平显著高于S-MWCNT处理组(P<0.05)，而L-MWCNT与L-MWCNT-COOH两组间效应差异无统计学意义。

Cells were treated with 6.25 μg/cm2 S-MWCNT,L-MWCNT or L-MWCNT-COOH for 4 h,12 h or 24 h,and the protein expression of NLRP3 were determined by western blot analysis.NLRP3,nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3;GADPH,glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.*P<0.05,△P<0.01 vs. untreated controls.# P<0.05 vs. S-MWCNT group.图5 MWCNTs的长度和羧基修饰对b.End3细胞NLRP3蛋白表达的影响Figure 5 Effects of length and carboxyl modification of MWCNTs on the expression of NLRP3 in b.End3 cells

3 讨论

MWCNTs的生物学效应与其理化特性(包括长度、直径、表面化学修饰等)有关[16-17]。现有研究中，用于构建药物载体的MWCNTs最长可达30 μm[18]，最短为 0.3 μm[19]；羧基修饰可以改善MWCNTs的分散性和亲水性，可作为铂类药物载体用于乳腺癌治疗[20]；羟基修饰的MWCNTs参与构建复合纳米纤维可用于胶质瘤治疗[21]；氨基修饰的MWCNTs具有穿过血脑屏障向脑部运输药物的可能[22]。本研究比较了长(10～30 μm)和短(0.5～2.0 μm)两种MWCNTs，以及未修饰与羧基、氨基、羟基4种常用化学修饰的MWCNTs。细胞毒性检测结果显示，所有类型的MWCNTs在高剂量下均会对内皮细胞造成明显的毒性损伤，而长度的缩短以及羧基、氨基或羟基修饰可以不同程度地减弱MWCNTs的细胞毒性。研究通过细胞毒性测定选取未对内皮细胞造成明显毒性的低剂量(0～12.5 μg/cm2)进行后续实验。

MWCNTs可诱导内皮细胞活化，主要表现为黏附分子的表达和分泌增加及对单核细胞的黏附力增强。Cao等[23]发现16～64 mg/L的MWCNTs作用于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)24 h，可诱导VCAM-1表达增加，并导致HUVEC对单核细胞的黏附增强。本研究发现，在无明显细胞毒性的剂量下(≥6.25 μg/cm2)，所有类型的MWCNTs均可诱导b.End3内皮细胞活化，表现为VCAM-1分泌增加，THP-1黏附增加，且观察到了明显的量效和时效关系。进一步比较发现，相同条件下，长度改变对MWCNTs诱导内皮细胞活化影响明显，但相同长度下，化学修饰对MWCNTs诱导内皮细胞活化效应无明显影响。既往的体外研究亦发现未修饰、羧基修饰和羟基修饰的MWCNTs均诱导HUVEC内皮细胞活化，但无明显差异[24-25]，这提示在无明显毒性剂量下，与化学修饰的改变相比，长度的改变对MWCNTs诱导内皮细胞活化的影响可能更明显。

有研究表明NLRP3炎性小体的激活是MWCNTs诱导炎症反应的重要机制[26-27]。体内外的多项研究证实NLRP3炎性小体激活参与调控内皮细胞活化[10-11]。然而，现有研究中缺乏MWCNTs激活内皮细胞中NLRP3炎性小体的相关证据。本研究发现，MWCNTs可以诱导b.End3细胞中NLRP3蛋白表达增加，在相同浓度下，长MWCNTs诱导NLRP3表达水平高于短MWCNTs，而未修饰和羧基修饰的MWCNTs之间无明显差异，与MWCNTs诱导内皮细胞活化的结果趋势高度一致。时效关系结果显示，MWCNTs对细胞NLRP3表达的影响出现在诱导细胞内皮细胞活化之前，提示MWCNTs可能是通过激活NLRP3蛋白表达来诱导内皮细胞活化；与化学修饰的改变相比，长度的改变对MWCNTs诱导内皮效应的影响更明显，提示长度可能是MWCNTs诱导NLRP3蛋白表达的重要因素。

综上所述，本研究通过比较长度和化学修饰在MWCNTs诱导b.End3内皮细胞活化效应的影响，发现无明显毒性剂量下，与化学修饰的改变相比，长度的改变对MWCNTs诱导内皮效应的影响更明显。MWCNT通过诱导NLRP3蛋白表达水平升高参与内皮细胞活化,因此，MWCNTs对内皮细胞活化的影响可能与NLRP3炎性小体的激活有关。在生物及医疗领域应用中，与化学修饰相比，改变MWCNTs的长度也许对于改善其生物相容性更有意义，这有待进一步研究加以验证。此外，鉴于在生物医疗领域相关的应用中，MWCNTs有可能直接接触血管内皮细胞，其安全性评价中应关注对血管内皮的生物效应。