不同地域烘焙咖啡豆风味性物质的检测与评价

智美丽 徐学万 吴立涛 潘 华 黄维兰 张 芳

（1.北京工业大学环境与生命学部，北京100124；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京100081）

咖啡是茜草科咖啡属常绿小乔木，原产地为非洲的埃塞俄比亚，其与茶叶、可可并称为世界的3大饮料[1]。目前世界上主要咖啡产区均位于北纬25°和南纬30°之间的区域，这个适合种植咖啡树的区域也被称为“咖啡带”。在咖啡的品质评价中，酸度是评价咖啡饮品的重要指标之一，影响咖啡酸度的主要物质是来自咖啡豆烘焙过程中产生的有机酸类物质[2]。烘焙咖啡豆中含有咖啡酸、绿原酸、富马酸、没食子酸、琥珀酸、无水柠檬酸、L－苹果酸、DL－酒石酸、D－（－）奎宁酸等30多种有机酸[3]，其中产生酸味的主要成分包括有无水柠檬酸和DL－酒石酸等[4]。苹果酸产生的酸涩味，会让人产生愉快的感觉[5]，而其他的有机酸则主要产生苦味[2]。D－（－）奎宁酸以游离形式或酯类形式存在于咖啡豆中，是用于合成流感药物达菲的起始材料[6]。咖啡酸具有调血脂、抗氧化的作用[7]。绿原酸和葫芦巴碱不仅是咖啡豆中含量较高的风味物质，还具有很多生物功效，例如抗菌[8]、抗氧化[9]、抗肿瘤[10]等功效。目前对咖啡豆的研究主要集中于加工方式对咖啡豆成分含量的影响[11～13]，咖啡豆中部分功效成分的检测以及功能研究等[14～16]，而评价不同地域对咖啡豆风味物质含量影响的研究报道则较少。咖啡种植的3大产区为中南美洲产区、非洲产区、亚洲及太平洋产区。我国种植咖啡豆的地区主要为云南省、海南省和台湾省。为了进一步探究不同地域对咖啡豆风味成分的影响，本研究选取市面上常见的进口咖啡豆，产地为意大利、肯尼亚、巴西和巴拿马，国产咖啡豆产地为我国云南省、海南省和台湾省，共7个产区的深度烘焙咖啡豆为研究对象，采用高效液相色谱质谱联用（HPLC－MS）的方法检测咖啡酸、绿原酸、富马酸、没食子酸、琥珀酸、无水柠檬酸、L－苹果酸、DL－酒石酸、D－（－）奎宁酸和葫芦巴碱这10种风味物质成分，并运用多元统计分析的方法对所得的数据进行分析，明确不同地域的咖啡豆的品质特征。

一、材料与方法

（一）材料与仪器咖啡酸（CAS：331－39－5，纯度98%）， 绿原酸（CAS：327－97－9， 纯度98%）， 富马酸（CAS：110－17－8， 纯度98%），没食子酸（CAS：149－91－7，纯度98%），琥珀酸（CAS：110－15－6，纯度98%），无水柠檬酸（CAS：77－92－9， 纯度98%），L－苹果酸（CAS：97－67－6， 纯度98%），DL－酒石酸（CAS：133－37－9， 纯度98%），D－（－） 奎宁酸（CAS：77－95－2， 纯度98%）， 葫芦巴碱（CAS：535－83－1，纯度98%）均购于上海源叶生物科技有限公司。甲醇、甲酸为色谱纯，购自福晨（天津）化学试剂有限公司；乙醇为分析纯，购自北京化工厂。Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱仪，美国Thermo公司；Thermo Scientific Q Exactive四极杆－静电场轨道阱高分辨质谱系统质谱仪，美国Thermo公司；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7μm）色谱柱，美国Waters公司；离心机，Centrifuge 5430/5430R，德国Eppendorf公司。

样品采集选用市面上常见产区的深度烘焙咖啡豆，品种为阿拉比卡种。进口咖啡豆的产区选自意大利（欧洲）、肯尼亚（非洲）、巴西（南美洲）、巴拿马（北美洲），国产咖啡豆产区选自我国云南省、海南省、台湾省。对这7个产区进行采样，每个产区采集10份样品，采样规格1～2 kg，样品采集后寄送到实验室，用磨粉机磨成细粉，过40目筛。

（二）咖啡豆中成分的提取方法咖啡豆中的有机酸与葫芦巴碱的提取方法参照杨剀舟等[17]和SMRKE等[18]的研究成果，并加以改进。精密称取不同产地的深度烘焙咖啡粉末0.50 g（精确至0.001g），置于50 mL离心管中，加入30 mL50%乙醇，于室温下超声提取40 min，5 500 r/min离心5 min，取上清液于50 mL容量瓶中，用50%乙醇定容，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取滤液用稀释剂稀释100倍，稀释剂为添加0.1%甲酸的甲醇－水溶液（甲醇∶水＝1∶9，V/V），待测。

（三）咖啡豆中成分的检测方法样品提取液采用高效液相色谱－四极杆静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC－Q/Orbitrap HRMS）进行测定，选用C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7μm），每次进样5 L，甲醇+1%甲酸为流动相A，水+1%甲酸为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序：0 min，3%A；2 min，3%A；3 min，90%A；5 min，90%A；6 min，3%A；8 min，3%A。柱温35℃，流速为0.2 mL/min，正/负离子切换扫描，高效液相色谱－质谱（HPLC－MS）的扫描范围为50～500 m/z，分辨率70 000 FWHM，正离子模式电压为3.8 kV，负离子模式电压为3.2kV。离子传输管温度为320℃，辅助气加热温度为350℃，质谱检测信息见表1。

表1 咖啡豆中风味性物质成分的质谱信息

（四）数据分析每个样品重复检测3次，最终结果用平均值表示。检测数据的多元统计分析采用SPSS26.0软件完成。

二、结果与分析

（一）咖啡豆风味性物质成分含量分析各风味成分标准品的HPLC－MS图见图1，可以看出，各物质得到了充分的分离。不同地域的咖啡豆样品各活性成分含量测定结果见表2，可以看出，绿原酸和葫芦巴碱是咖啡豆中含量较高的风味物质，其中绿原酸的含量为7.14～20.58 mg/g，葫芦巴碱的含量为9.48～29.26 mg/g。绿原酸是一种缩酚酸，具有抗菌、 抗病毒[14，19]、 清除自由基[15]、 抗炎[20]、抗氧化[21]等作用。葫芦巴碱是生物碱类物质，现代医学研究表明，其具有降低血糖、降低血脂[16]、保护肾脏[22]、保护心血管及心脏[23]等药理作用。没食子酸和DL－酒石酸的含量最低，均低于0.004 0 mg/g。

不同地域咖啡豆总风味物质的总含量情况见图2，可以看出，7个产地的咖啡豆样品中，巴拿马咖啡豆样品总风味物质的含量明显高于其他产地的咖啡豆样品，为71.93 mg/g；我国海南省和台湾省的样品风味物质含量都较低，分别为37.92 mg/g和36.92 mg/g。国产咖啡豆中，云南省的咖啡豆风味物质含量较高，表明其品质较好，口感较其他国产咖啡丰富。在7个来源地中，产区为巴拿马的咖啡豆样品绿原酸、无水柠檬酸、L－苹果酸和葫芦巴碱的含量最高，分别为20.58、8.79、3.45和29.26 mg/g。我国台湾产区的咖啡豆绿原酸含量最低，为7.14 mg/g，比巴拿马样品降低了65.31%。我国海南产区的咖啡豆葫芦巴碱含量最低，为9.48 mg/g，比巴拿马样品降低了67.59%。

图1 咖啡豆中风味性物质成分标准品的HPLC-MS图

表2 不同地域咖啡豆风味性物质含量（mg/g）

图2 不同地域咖啡豆风味性性物质总含量

（二）咖啡豆风味性物质含量的化学计量学分析

1.主成分分析。对7个产地深度烘焙咖啡豆样品的10种活性成分进行主成分分析，得到主成分载荷阵见表3，共提取出了3个主成分，累计贡献了79.03%的方差，表明原始数据的大部分信息可以被因子提取，因子分析的结果是有效的。从表3中可以看出，富马酸、D－（－）奎宁酸、咖啡酸、琥珀酸的第1主成分特征向量系数最高，即这4种成分主要载荷于第1主成分；L－苹果酸、葫芦巴碱、绿原酸、无水柠檬酸主要载荷于第2主成分；DL－酒石酸和没食子酸则主要载荷于第3主成分。

表3 咖啡豆风味性物质主成分载荷阵

计算各产地烘焙咖啡豆样品中风味物质的主成分得分，各地的平均得分如图3所示，从图中可以看出，不同产地烘焙咖啡豆样品中第3主成分得分差别不大，说明地域因素对载荷于第3主成分的DL－酒石酸和没食子酸的影响较小。产地为云南的样品中第1主成分得分最低，即云南产区的烘焙咖啡豆中富马酸、D－（－）奎宁酸、咖啡酸、琥珀酸的含量较其他地区低。对烘焙咖啡豆风味及口感影响较大且含量较多的葫芦巴碱和绿原酸都载荷于第2主成分，由图3可知，巴拿马来源的咖啡豆第2主成分得分最高，即巴拿马咖啡豆中葫芦巴碱和绿原酸含量较高，其口感更为丰富。同样，来自于海南产区的咖啡豆相对逊色，可能与咖啡树的栽种环境有关。

图3 不同地域咖啡豆风味性物质主成分得分图

2.聚类分析。对7个产地咖啡豆样品中10种风味物质的含量进行聚类分析，如图4所示。从图中可以看出，所有的咖啡豆样品，按照咖啡豆中主要风味物质富马酸、D－（－）奎宁酸、咖啡酸、琥珀酸、L－苹果酸、葫芦巴碱、绿原酸、无水柠檬酸、DL－酒石酸、没食子酸的含量及其分布特点来划分，可以分为3大类，分别为A类、B类和C类。每类样品的产地来源如表4所示。其中A类样品中含有32个样品，绿原酸和葫芦巴碱的含量较低，约80%的样品中绿原酸和葫芦巴碱的含量分别低于10 mg/g和15 mg/g；B类样品中含有DL－酒石酸，含量为3.8～8.5μg/g，而A类和C类样品中没有检测到酒石酸。C类样品中样品个数最少，只有11个，但所有样品都来自国外，其中来自巴拿马的样品占C类样品总量的54.5%。C类样品的特点是载荷于第2主成分的L－苹果酸、葫芦巴碱、绿原酸、无水柠檬酸含量均显著高于其他样品，L－苹果酸含量均高于2.8 mg/g，无水柠檬酸含量均高于7.5 mg/g，50%的样品中葫芦巴碱含量均高于30 mg/g。说明气候条件和地理位置对咖啡豆的品质影响较大，其中巴拿马的咖啡豆风味物质含量较高，品质较好。10种风味物质按照样本的含量高低也聚为3类，葫芦巴碱、绿原酸、L－苹果酸、无水柠檬酸为一类，DL－酒石酸和没食子酸为一类，富马酸、咖啡酸、D－（－）奎宁酸、琥珀酸为一类，聚类结果与主成分分析的结果一致（见图5）。

图4 不同地域咖啡豆风味性物质含量聚类热图

表4 3类样品来源汇总

图5 咖啡豆风味性物质成分组件空间图

3.判别分析。为了进一步确定咖啡样品分类结果的可信度，通过判别分析对不同产地的咖啡豆样品进行交叉验证，结果见表5。其中交叉验证遵循“留一个在外”的原则，即每组是通过除了这个组以外的其他组推导出来的判别函数来分类的。由表5可以看出，通过判别函数的预测，有55个样品是分类正确的，即有78.6%的原始样品被判对。图6为咖啡样品判别分组的分类结果图，从图中可以看出，7组的质心可以得到明显的区分。70个样品中除个别样品在重合区域外，大部分样品分组清晰，与聚类分析的结果保持一致。

图6 不同地域咖啡豆风味性物质判别分组结果

表5 不同地域咖啡豆风味性物质判别分析结果

三、讨论

咖啡作为世界3大饮品之一，备受不同消费人群的青睐，对咖啡的质量进行评价尤为重要。有机酸等物质是咖啡中重要的成分，影响咖啡的风味及口感，所以对咖啡中有机酸的含量进行检测，更能科学全面地评价咖啡豆的品质。咖啡酸、绿原酸、富马酸、没食子酸、琥珀酸、无水柠檬酸、L－苹果酸、DL－酒石酸、D－（－）奎宁酸、葫芦巴碱是咖啡豆中主要的风味物质，这些有机酸类物质可以改善毛细血管壁的通透性、增强毛细血管的弹性[24～25]。在检测的咖啡样品中的10种风味物质中，所有的样品中葫芦巴碱和绿原酸的含量较高，而没食子酸、琥珀酸、DL－酒石酸含量较低。绿原酸是由咖啡酸与奎宁酸生成的一种缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物[26]。绿原酸在咖啡生豆中的含量较高，咖啡豆经过烘焙，绿原酸发生美拉德反应生成一些复杂的化合物，使绿原酸的含量较生豆有些下降[27]。绿原酸是影响咖啡酸度的重要物质，并且赋予咖啡收敛性和苦味[28～29]。葫芦巴碱是一种生物碱类物质，其受热易分解，可以生成大量的二氧化碳以及风味物质[30]，所以与绿原酸类似，烘焙咖啡豆中的葫芦巴碱含量也低于咖啡生豆。

由采用主成分分析与聚类分析的结果可以发现，巴拿马的咖啡样品在载荷于第2主成分中的L-苹果酸、葫芦巴碱、绿原酸、无水柠檬酸的含量中占有很大的优势。意大利和我国台湾产区的咖啡样品各主成分的得分差别不大，即这两个产地的咖啡豆样品各风味物质的含量差别不大。意大利大部分地区属亚热带地中海式气候，传统的意式咖啡豆口感醇厚，酸度甜度很高。肯尼亚受益于火山土壤，咖啡有较鲜明的水果味，酸度较为密实。巴西是咖啡生产大国，种植约全球1/3的咖啡树，巴西产区海拔较低，有很多低于1 000 m的庄园用于咖啡的种植，地貌较为平坦，气候稳定，优质咖啡产量较低，咖啡口感酸度低，较为甜美，呈现巧克力气息。巴拿马境内咖啡产区有不少独特的微气候，所以巴拿马产区拥有很多质量绝佳的咖啡，现今精品咖啡产业的发展对巴拿马咖啡来说无疑是一个很好的机会。在我国，云南省地处我国西南边陲，气候基本上属于亚热带和热带季风气候，平均气温较高，年温差小，十分适合种植小粒种咖啡等热带经济作物，口感较为丰富，带有木质气息。海南省土壤肥沃，自然环境优良，咖啡味道香浓，口感高，有着天然的奶香味、巧克力香味。我国台湾省是一个充满丘陵与高山的海岛，咖啡豆需要较为炎热的环境来促使成熟，只有台湾省中南部的山区有足够的条件孕育出优质的咖啡豆，台湾省咖啡有水果的甜香味，口感较为丰富。

四、结论

本研究基于多元统计分析探析不同区域咖啡豆中风味性物质含量及其差异规律，检测分析了7个不同产地10种风味性物质的含量，采用多元统计分析的方法进行了深入研究。研究结果表明，绿原酸和葫芦巴碱是咖啡豆中主要的风味物质，其中产地为巴拿马的咖啡豆样品中绿原酸和葫芦巴碱的含量最高，分别为20.58 mg/g和29.26 mg/g。我国台湾省的咖啡豆绿原酸含量最低，为7.14 mg/g。其他风味物质含量差异不大，其中没食子酸、DL－酒石酸含量最少。通过主成分分析和聚类分析发现咖啡样品的风味物质含量受地域影响较大，其中巴拿马的咖啡样品具有明显的独特性。本研究将为今后咖啡豆产业的科学监管、加工指导以及居民的健康消费提供技术支撑与理论依据。