清开灵、莲必治分别联合不同抗生素对ICU 耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的体外抑菌效果

刘 佳，陶庆春，李公民，赵玉玲，程丽娟，蔡洁新

（1.北京市房山区中医医院检验科，北京 102400；2 北京中医药大学第三附属医院检验科，北京 100029；3.北京燕化医院检验科，北京 102500；4.北京良乡医院检验科，北京 102401；5.北京市房山区第一医院检验科，北京 102400）

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是逃避抗菌药物作用最严重的六大超级细菌之一[1]，也是重症监护病房（ICU）感染的主要致病菌。临床上可引起伤口感染、败血症和呼吸机相关肺炎等疾病[2]。近年来耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（CRAB）的检出率及耐药率呈快速增长的趋势，探索中西医药物联合治疗成为临床研究热点。目前治疗鲍曼不动杆菌的首选抗生素分别为头孢他啶、头孢哌酮钠舒巴坦钠、哌拉西林钠他唑巴坦及亚胺培南西司他丁钠。清开灵注射液为中药复方制剂，具有清热解毒、化痰通络等作用[3]，还有一定的抑制革兰阴性杆菌生长作用及联合抗菌药物治疗细菌感染的效果[4]。莲必治注射液是单一成分为穿心莲内酯的中药注射剂，具有抗炎、抗病毒等作用[5，6]。本研究收集2019 年1 月～11 月北京市房山区中医医院、北京燕化医院、北京良乡医院、北京市房山区第一医院ICU 分离出的30株标本，分析清开灵、莲必治注射液分别联合四种抗生素对ICU 收集的30 株CRAB 菌株体外抑菌效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源 收集2019 年1 月～11 月北京市房山区中医医院、北京燕化医院、北京良乡医院、北京市房山区第一医院ICU 分离出的30 株标本，排除同一患者的同一部位重复送检。通过全自动微生物鉴定和药敏分析系统确定为CRAB 菌株。

1.2 试验药物 清开灵清注射液10 ml/支（神威药业集团有限公司，生产批号：180116D1）；莲必治注射液5 ml/支（江苏九旭药业有限公司，生产批号：201907012）；头孢他啶0.5 g/瓶（海南海灵化学制药有限公司，生产批号：1906201）；头孢哌酮钠舒巴坦钠1.5 g/瓶（辉瑞制药有限公司，生产批号：AX0181）；哌拉西林钠他唑巴坦2.5 g/瓶（华润双鹤药液股份有限公司，生产批号：Q1807301）；亚胺培南西司他丁钠1.0 g/瓶（杭州默沙东制药有限公司，生产批号：R023135）。

1.3 实验仪器和设备 M-H 肉汤培养基（英国OXOID 公司）、Class ⅡBSC 生物安全柜（ESCO 公司）、VITEK2 Compact 全自动微生物鉴定和药敏分析系统（法国生物梅里埃）、电热恒温培养箱（上海樹立儀器儀表有限公司）、96 孔板。

1.4 实验方法

1.4.1 菌液配制 分别取经分纯的30 株CRAB 菌落，各用5 ml 生理盐水配制成0.5 麦氏比浊菌液，再用MH 肉汤进行稀释，保证加入96 孔板内20 μl 菌液浓度是5×105CFU/ml。

1.4.2 药物最低抑菌浓度（MIC）测定 清开灵、莲必治最高浓度（原液）1000 μl/ml（1∶1），稀释原液（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128），头孢他啶、头孢哌酮钠舒巴坦钠、哌拉西林钠他唑巴坦及亚胺培南西司他丁钠的最高浓度1024 μg/ml，四种抗生素分别用MH 肉汤稀释至1024 μg/ml、512 μg/ml、256 μg/ml、128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml。最后，将不同浓度的药液各取180 μl，菌液20 μl 加入至96 孔板摇匀。每组做空白和阳性对照，37 ℃培养24 h 后观察上述药物分别对30 株CRAB 抑菌的MIC 结果。

1.4.3 联合抑菌MIC 测定 根据上述药物分别对30株试验菌的MIC 值来确定2 倍MIC 最高稀释浓度，将联合应用的两种药物的最高浓度分别倍比稀释配制成8 个不同浓度30 组。采用棋盘稀释法，每组横排分别加入稀释后不同浓度的清开灵，竖排为稀释后不同浓度抗生素各90 μl，每孔加菌液20 μl 后摇匀，35 ℃培养24 h，记录两种药物联用时最佳抑菌组合各药液的MIC 值，并计算抑菌浓度指数（FIC）指数。

1.4.4 结果判读 FIC 指数=甲药联合的MIC／甲药单用的MIC＋乙药联合的MIC/乙药单用的MIC。FIC 指数≤0.5 表明两药联合为协同作用；0.5＜FIC≤1 表明两药联合为相加作用；1＜FIC＜2 表明两药联用为无关作用，FIC＞2 表明两药联用为拮抗作用。

1.5 统计学方法 数据录入Excel 进行分析，计数资料以（n）和（%）进行描述。

2 结果

2.1 药物单用及联用的MIC 结果 莲必治单用有1株抑菌浓度MIC 为1∶2，其余29 株MIC 均为1∶1。清开灵单用MIC 值范围为1∶4～1∶2，见表1。联用头孢哌酮钠舒巴坦钠的MIC50 和MIC90 分别是32、64 μg/ml，另外三种抗生素的MIC50、MIC90 均为64 μg/ml。清开灵联合头孢哌酮钠舒巴坦钠的MIC50 降低最明显，清开灵MIC50 降低1/8，头孢哌酮钠舒巴坦钠MIC50 降低2 倍，见表2。

表1 清开灵、莲必治及四种抗生素单用对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的MIC 及菌株数量（n）

表2 清开灵及抗菌药物单用及联合应用MIC 值范围

2.2 清开灵联合抗生素的菌株数量分析 清开灵1∶8+头孢他啶64 μg/ml 菌株数量分布最多，占80.00%；清开灵1∶16+头孢哌酮钠舒巴坦钠32 和64 μg/ml、清开灵1∶8+头孢哌酮钠舒巴坦钠64 μg/ml菌株数量相同，占23.33%；清开灵1∶8+哌拉西林钠他唑巴坦64 μg/ml 菌株数量最多，占46.67%；清开灵1∶8+亚胺培南西司他丁钠64 μg/ml 菌株数量最多，占53.33%，见表3。

表3 不同浓度清开灵联合四种抗生素的菌株数量（n）

2.3 联合抑菌FIC 结果 由于莲必治原液抑制CRAB浓度过高，未开展联合试验。清开灵分别联合四种抗生素的FIC 协同作用范围为13.33%～40.00%，相加作用范围为46.66%～80.00%，无关作用范围为6.67%～26.67%，拮抗作用均为0，见表4。

表4 清开灵联合用药的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌FIC 结果[n（%）]

3 讨论

随着患者入住ICU 的时间延长及老年患者机体抵抗力下降等因素易造成CRAB 的感染出现多耐药[7]，是临床亟待解决的治疗问题。中、西医药物联合体外抑菌实验结果证实[8]，中药具有耐药性低、多作用靶位的广谱抗菌效果、抑菌效果明显等优点。清开灵注射液对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等有较强的抑制作用[9，10]。马维娜等[11]研究发现，清开灵对鲍曼不动杆菌有一定的抑制作用，与抗菌药物联用后表现为协同或相加作用，抗菌药物浓度降低可达到较好的抑菌效果，且与头孢哌酮舒巴坦联用后协同作用最明显。莲必治中的穿心莲誉为“中药抗生素”，穿心莲内酯提取物可抵抗流感病毒、轮状病毒、疱疹病毒等，其疗效较好、不良反应少[12-14]，但穿心莲注射液体外抑制CRAB 效果较差。

本研究中清开灵、头孢他啶、头孢哌酮钠舒巴坦钠、哌拉西林钠他唑巴坦、亚胺培南西司他丁钠单用及联合应用的MIC 值范围表明，清开灵注射液单独应用有很好的体外抑菌效果，其与四种抗生素药物联合应用较各单用比MIC 范围、MIC50、MIC90 均有明显浓度降低，特别是与头孢哌酮钠舒巴坦钠联合，清开灵的MIC 浓度降低16 倍、MIC50 降低8 倍，说明二者联合抑菌时应用药物浓度剂量最少。不同浓度的清开灵与四种抗生素联合应用的菌株数量结果表明，清开灵1∶8+头孢他啶64 μg/ml 菌株数量分布最多，占80.00%；清开灵1∶16+头孢哌酮钠舒巴坦钠32 和64 μg/ml、清开灵1∶8+头孢哌酮钠舒巴坦钠64 μg/ml 菌株数量相同，占23.33%；清开灵1∶8+哌拉西林钠他唑巴坦64 μg/ml 菌株数量最多，占46.67%；清开灵1∶8+亚胺培南西司他丁钠64 μg/ml 菌株数量最多，占53.33%，说明除头孢哌酮钠舒巴坦钠外，清开灵1∶8 时其余三种药物的浓度均为64 μg/ml菌株数量所占比最多。通过计算FIC，结果显示清开灵与四种抗生素的相加作用均达到了70.00%以上，其中头孢哌酮钠舒巴坦钠、哌拉西林钠舒巴坦钠作用最明显。因此，清开灵与上述两种药物相加协同作用突出，效果较好。

综上所述，莲必治注射液单用未能显示较好的体外抑菌作用，而清开灵注射液联合头孢哌酮钠舒巴坦钠、哌拉西林钠他唑巴坦相加和协同作用明显，对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌体外抑菌效果较好。因此，临床制定治疗CRAB 感染的联合用药方案可参考每种抗菌药物的MIC 值选用具有相加和协同效应的药物，避免药物之间出现拮抗无效作用。