二代测序技术在儿童白血病诊治中的应用

蔡丽雯，徐晓军

（浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科，浙江 杭州 310003）

二代测序（next-generation sequencing，NGS）又称下一代测序，是可以并行测定大规模DNA 碱基对的技术[1]。近年来，二代测序技术以其高通量、高灵敏度、易于操作、相对定量等优点，在精准医学领域迅速发展应用。在儿童白血病领域，通过二代测序技术，越来越多的突变基因被证实在疾病起源、病情发展、预后及复发等各个方面具有重要意义。通过检测追踪相关基因，可以对白血病患者的治疗反应进行预测及分层治疗，使白血病的治疗更加精确。此外，不同时间点对白血病相关突变基因进行NGS检测也能及时发现新的突变并追踪白血病克隆演变。本文通过分析国内外相关文章，对二代测序在儿童白血病初诊、微小残留病变监测及克隆演变追踪方面的应用进行探讨。

1 NGS 在初诊白血病的应用

与以往传统的测序技术相比，NGS 实现了大规模并行测序，可以全面、高效率地发现更多有意义的突变基因，同时加深对已发现基因的理解。近年来，NGS 逐渐演变出针对不同目的检测的多种策略[2]，目前认为对于初诊白血病具有应用价值的主要有高深度Panel、全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）、转录组测序（RNASeq）、全免疫组测序（immune repertoire sequencing，IRseq）和单细胞测序技术[3]。这些技术的结合可以更好地应对白血病基因的复杂性，也为揭示白血病突变基因与临床特征及预后的联系提供了更多证据。

高深度Panel 的检测范围相对传统Panal 而言更全面，包含了血液肿瘤的常见基因，灵敏度可达到0.03%，对于白血病这类疾病而言针对性强，检出率高，并使后续多个基因的监测更为便捷[4]。由于其测定目标明确，在成本上也就相对低，更具经济适用性，对于临床诊断明确的白血病患者而言是一个较好的选择。但这种方法检测基因较固定，对于未包含在内的基因则无法检出，也不能发现新的突变基因。WES 可以测定全部外显子基因，对于体细胞与胚系的突变谱都具有检测意义，灵敏度通常在1%。由于其检测范围十分广泛，可延伸发现更多有临床意义的基因，为科研跟临床提供了重要的研究资料。其对胚系突变的检测也可将胚系突变遗传病相关的白血病与一般的白血病区分开来，协助诊治。如当WES测出白血病患者ATM 基因存在突变时，则提示可能为共济失调性毛细血管扩张症相关白血病[5]，需结合该遗传病调整治疗方案。正是由于WES 测定内容之广，其价格也比较昂贵。

RNASeq 检测的是全部编码氨基酸的序列，涉及到RNA 编辑的过程，与表现出的临床特征也就更为紧密。尤其是对于融合基因而言，理论上RNASeq可以测出全部融合基因，而不受到染色体断裂位置及组合基因等因素的限制，也就为发现新的融合基因提供了方法[6]。在过去的研究中，应用RNASeq 发现了多种新的融合基因[7]，包括IGH-DUX4、ERGDUX4、ETV6-NID1、IKZF1-NUTM1 等[8]，这些基因的发现为研究融合基因与白血病临床特征的联系提供了更多方向。

IRseq 是对肿瘤细胞BCR/TCR 的全部克隆进行测序，肿瘤细胞表面存在标志性的免疫细胞受体，可与正常细胞相区分，只要初期分辨出肿瘤细胞的BCR/TCR，后期监测的精确度就会大大提高，这项技术的灵敏度也很高，可以达到百万分之一。由于其灵敏度之高，目前认为用其追踪MRD 可以超越传统的检测方法。

单细胞测序技术针对的则是单个细胞，对细胞各自的表达谱进行检测，分辨出不同细胞之间的差异，相对于其他几种技术是对整个样本进行检测而言，单细胞测序技术在分析肿瘤异质性方面具有独特的优势[9]，所需要的技术支撑也更为严格，也正因为如此，价格也相对昂贵，且目前临床应用较少。主要NGS 技术的比较见表1。

表1 主要NGS 技术的比较

在NGS 出现之前，已经有很多基因被证明与患者的预后密切相关，也日渐用于临床。NGS 的出现及发展为这方面的研究提供了更多的便利，更多的基因被发现可能提示一定的临床特征。目前白血病的危险度跟预后已经有了完整的评价标准，发病年龄、药物敏感性、染色体核型、融合基因、MRD 等都具有参考意义。突变基因通过各种途径表达为临床特征的差异，进而影响白血病预后。随着NGS 对越来越多基因的发现及其与临床关系的探索，白血病预后的判断将有望进入更精准的层次。

2 利用NGS 结果进行微小残留病变（MRD）监测

在儿童白血病的治疗过程中，MRD 与复发及预后相关[10]，需要定期监测以评估病情进展与治疗效果，及时调整治疗方案。对于MRD 过高并在治疗过程中未降至预期值的患者，需要重新评估危险度，提升化疗强度或换用敏感药物，监测频率也会提高。因此，找到一种最适合进行MRD 监测的检测方法就格外重要。

以往MRD 的检测主要有多参数流式细胞术（MFC）和实时定量PCR（RQ-PCR）两种方法[11]。MFC是通过白血病细胞异常的免疫表型对其进行捕获，这涉及到不同类型的白血病细胞表面独特的免疫标记，区别于正常的细胞，可对白血病进行分型并检测MRD。RQ-PCR 则是通过白血病特异的分子标记进行扩增后来检测MRD。近年来一些新兴的技术也逐渐被发掘，如数字PCR，其错误率相对于传统技术更低，灵敏度更高，对于数据的分析也相对简洁，但并不适用于初诊白血病的检测，其应用也缺乏标准化[12]。随着NGS 的发展，其在MRD 检测方面的应用也越来越成熟，与其他技术相比，其优势也逐渐显现。

MRD 评估的关键在于准确性跟灵敏度，这就需要能够针对所有细胞的具有高度特异性的标记。MFC 的灵敏度不定，有时达不到10-4，正常淋巴细胞也可能共表达某些ALL 抗原导致假阳性[13]，患者经治疗后若出现抗原漂移则会导致假阴性。RQPCR 常用于扩增源于白血病细胞的基因组DNA，这是MRD 检测中常见的方法，但非常耗时费力，不能绝对定量，灵敏度也不是非常高。而NGS 作为测定MRD 的方法，灵敏度跟准确性都可以得到保证，即使对于低频突变也能得到可靠结果，基本可以适用于各种类型的白血病，且在测序过程中不需要依赖于引物，尤其是患者进行干细胞移植后，细胞的大量增殖使MFC 及RQ-PCR 检测MRD 存在假阳性可能，此时，应用NGS 可以得到更精确的结果[14]，RD检测方法比较见表2。

表2 MRD 检测方法比较

目前，应用NGS 检测白血病MRD 主要有检测基因突变与检测白血病特异性IgH/TCR 两种方法[10]。白血病肿瘤细胞存在多种不同的基因突变，通过NGS可以高效率地对已知的基因突变进行检测，即只要明确了作为MRD 监测的突变点，就可以达到追踪MRD 的目的。目前常用高深度Panel 检测突变基因来进行MRD 的追踪，即在初诊时检测出全部的突变基因，后续也可应用高深度Panel 同时动态监测多个基因的变化，不需要合成特异性的引物，过程相对简便，省去了传统方法的繁琐与重复性，灵敏度高且稳定，适用于各种类型的白血病。另一方面，由于白血病细胞是恶性增殖的结果，其IgH/TCR 呈现单克隆[15]，灵敏度跟特异性都比较高，这一特性使其成为了MRD 可靠的检测靶点，且这种特点是相对稳定的，不存在太大的演变，后续只要追踪已知IgH/TCR 的丰度就能得到可靠且灵敏的结果。就如上文提到过的，选用IRseq 技术可以更加精准地对MRD进行检测和定量，具体方法是初诊时确定肿瘤细胞上独特的IgH/TCR，后续监测其丰度。

3 利用NGS 进行白血病克隆演变的追踪

在白血病的诊治过程中，由于受到各种因素包括自身及环境的影响，突变基因的类型、数量、位点是进行着动态演变的，与病情的动态变化相关，对治疗效果、预后判断及复发概率都有重要的指导意义[16]。目前发现的白血病克隆演变主要有以下几种：①克隆基本不变的稳定模式；②主克隆保持不变，亚克隆发生改变的线性演变模式；③主克隆与亚克隆共同发展变化的分支演变模式[17]。克隆演变的多样性跟复杂性需要找到一种最适合的方法来进行追踪以指导临床，利用NGS 进行此类追踪以其独特的优势得到越来越多的认同。

在NGS 出现前，测序的范围有限，无法进行大规模并行测序，在检测患者基因时，常常只能有针对性地检测原有的突变基因，却忽略了初发时低于检测阈值或后续新出现的突变基因[18]，以至于很多患者在复发后再次进行全面的基因检测才发现新的突变，这种情况下就会延误治疗。而NGS 的优势在于每次都可以进行全面的基因检测而不局限于原有的突变，灵敏度高，能及时发现新的突变，并结合该突变的意义协助评估病情。NGS 的推广也让白血病克隆演变的信息采集更为直观，为后期治疗方案提供可靠证据，也为临床研究提供了更多宝贵的数据。

追踪白血病克隆演变的重要目的是评估复发风险[19]，及时调整治疗方案。基因跟临床的相关性给我们提供了思路，即有些基因跟白血病复发高度相关。2020 年发表于BLOOD 杂志的一项最新研究指出，儿童ALL 患者复发时伴随多个常见的基因突变，如：NT5C2、CREBBP 等[20]。其可能初发即存在，也可能在后期才出现，及时发现这部分基因可以对患者白血病复发的概率做出前瞻性预测，并及时采取相应策略防止复发。基于白血病复发的危险性及NGS技术高通量、高灵敏度等优点，对于病情危险度高，或治疗效果不理想的患者，在有条件的前提下，建议利用NGS 定期进行全面的基因检测，追踪克隆演变，以便及时发现复发的趋势。

白血病治疗过程中的难题之一是肿瘤细胞对药物产生耐药性[21]，分子层面的机制往往是患者基因在环境与药物等多种因素选择下发生新的突变或亚克隆发展为主克隆，该突变对药物不敏感而导致疗效不佳。目前已发现有多种基因提示跟耐药性相关，利用NGS 重点关注该类基因可以更快发现耐药倾向。另外，利用NGS 发现患者各个阶段的主克隆可以及时进行靶向治疗。目前白血病治疗中，针对分子层面的靶向药物已经成为一个重要领域[22]，当发现一个明确与白血病发病相关的基因时，可以针对其表达产物及下游因子研究抑制性药物，治疗效果常常优于仅使用常规化疗药物。

4 总结

随着精准医学概念的深入，可以预测儿童白血病的研究与临床诊疗必将越来越依赖于分子生物学手段。二代测序以其大规模并行测序的优势可以全面评估基因信息，给出临床上的病情评估与治疗方向，真正做到个体化、灵活性、可预测。二代测序面世后日趋成熟，但新的数据与信息也一直在对其进行完善与补充。在未来的研究和临床实践中，临床医师要正确理解NGS 的意义和临床应用指征，使之能为更多的白血病患者服务。