长链非编码RNA MIAT 在2 型糖尿病外周血单核细胞中的表达及相关性分析

耿 佳，刘 芬，曹 莹，3，邢 远，3，王雪梅，，3

（1.西安医学院公共卫生学院卫生学教研室，陕西 西安 710021；2.新疆医科大学第一附属医院动物疾病模型研究重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054；3.陕西省公共安全医学防控研究中心，陕西 西安 710021）

据估计，全世界年龄在20～79 岁人群中，有4.15 亿是糖尿病患者，每年约有500 万人死于糖尿病及其并发症，糖尿病相关疾病的医疗费用估计为6730 亿美元。此外，截止2025 年，糖尿病患者将增至5.6 亿，约占全球人口的7%。现阶段临床上主要通过综合治疗控制血糖，但是大多数2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者的血糖控制并不理想，易造成心、脑、肾等系统出现并发症，疾病预后较差，病死率较高[1]。当前医学认知认为T2DM 是由于多种遗传易感因素、环境和行为因素的相互作用所导致的，各种因素如何发挥作用有待进一步阐明[2]。空腹血浆葡萄糖（fasting blood-glucose，FBS）和口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）是糖尿病诊断的“金标准”[3]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200 个核苷酸的非编码RNA。研究表明[4]，lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，作为遗传易感因素，从基因水平转录调节或转录后调节能量代谢，成为遗传学研究热点。同时，人体2 型糖尿病相关的许多单核苷酸多态性位点都是坐落在lncRNA 区域内，其中长链非编码RNA 心肌梗死相关转录本（myocardial infarction-associated transcript，MIAT）在急性心梗和T2DM 及其并发症中的表达都存在显著差异[5]。不同于mRNA，lncRNA 作为生物标志物有自身的优势，其本身就是功能分子，其的表达水平能更好地反映疾病状态，其表达模式高度特异，提示其表达状态可以被用于某些疾病的精细分期或分类。因此，本研究从基因水平分析lncRNA MIAT 与临床指标之间的联系，作为T2DM诊断标志物的价值及参与调控T2DM 的机制，为T2DM 的寻找新的生物诊断和治疗靶点，提供有价值的理论基础和实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年8 月～2018 年2 月在新疆医科大学第一临床附属医院入院进行就诊的100例汉族T2DM 患者作为T2DM 组。纳入标准：依据2013 年中国糖尿病防治指南公布的2 型糖尿病诊断标准：空腹血浆葡萄糖≥7.0 mmol/L 或口服糖耐量实验（OGTT）后2h 血糖≥11.1 mmol/L 或既往有确切糖尿病病史、正在使用降糖药物或胰岛素者。排除标准：①其他特殊类型糖尿病；②恶性肿瘤；③慢性炎症等相关疾病；④严重的心肝肺肾等疾病；⑤自身免疫性疾病。选择同期在该院进行就诊的汉族非T2DM 患者作为对照组，共100 例。纳入标准：空腹血浆葡萄糖＜6.1 mmol/L 和OGTT 后2h 血糖＜7.8 mmol/L。排除标准：①既往诊断为2 型糖尿病；②合并其他内分泌疾病；③恶性肿瘤；④急、慢性感染及严重传染性疾病患者；⑤严重的心肝肺肾等疾病；⑥自身免疫性疾病。所有研究对象均为无血缘关系并且在新疆地区长久居住的常住人口，排除了环境差异而引起的基因变异。本研究方案经新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，研究对象均自愿签署书面知情同意书。

1.2 血生化指标的测定 采集两组清晨空腹抽取静脉血5 ml，全血样本在室温下保存30 min，以使血液凝固。样品在4 ℃下3000 r/min 离心10 min 分离血清，用全自动生化分析仪应用标准试剂盒检测包括FPG、餐后2h 血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血尿酸、肌酐、尿素等生化指标。生化指标均由新疆医科大学第一附属医院检验中心统一测定。

1.3 外周血RNA 提取和反转录 将3～5 ml 肝素抗凝全血样品以3500 r/min 离心10 min，用淋巴细胞分离液（Solarbio，中国）分离单核细胞，将分离出来的单核细胞用4 ℃预冷的D-Hanks 缓冲液冲洗2次，离心沉淀后加入l ml 细胞裂解液（Trizol，Invitrogen，USA），置于冰上反复轻轻吹打细胞至混匀。常规方法提取细胞总RNA，按照试剂说明将RNA 逆转录合成cDNA（Thermo，USA）。

1.4 实时荧光定量PCR 法检测lncRNA 的表达 检测 lncRNA MIAT 的编号、lncRNA 的位置和扩增引物见表1。按照SYBR GREEN 试剂盒（Applied Biosystems，USA）说明书，应用实时荧光定量PCR 仪（500 HT Fast real-time PCR system，BIO-RAD，USA）进行实时荧光定量反应测定相关RNA 分子的表达。

表1 选取的T2DM 相关lncRNAs 分子的位置和实时荧光定量反应的引物序列

1.5 统计学方法 采用IBM SPSS 22.0 统计软件进行统计分析。计量资料用（）表示，计数资料用（n）和（%）表示，做χ2检验。连续型变量的比较采用独立样本t检验。采用实时荧光定量PCR 的数据分析采用2-△△CT法，△CT=目的基因CT 值-内参基因CT 值，△△CT=T2DM 组△CT 值－对照组△CT 值。相关性检验采用Spearman 法检测，ROC 曲线法分析其作为诊断标志物的价值。多变量Logistic 回归分析MIAT 与T2DM 的关系，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组性别、年龄、体重指数、舒张压、尿素、肌酐和尿酸比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组高血压、收缩压、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、空腹血糖和餐后2 h 血糖比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组一般资料比较[，n（%）]

表2 两组一般资料比较[，n（%）]

注：a 代表连续型变量的比较采用独立样本t 检验，b 代表计数资料用χ2 检验

2.2 外周血中lncRNA MIAT 的表达 通过检测lncRNA MIAT 在T2DM 组和对照组的表达发现，在糖尿病患者的外周血中MIAT 的表达显著升高，差异表达倍数是（1.90±0.85）vs（1.11±0.66）（P=0.004）。

2.3 评价MIAT 作T2DM 生物标志物的价值 通过ROC 曲线分析，MIAT 的AUC 为0.753（95%CI=0.689～0.817）见图1，MIAT的最佳临界点的是0.950，相应的灵敏度是0.970，特异度是0.470，95%CI=0.686～0.820。进行多变量Logistic 回归分析，进一步验证MIAT 是T2DM 的危险因素 [OR=1.527，95%CI=1.130～1.919]，见表3。进一步检测了lncRNA MIAT 表达与糖尿病危险因素、血糖水平指标之间的相关性。Spearman 相关性分析结果表明，lncRNA MIAT 的变化与高血压、低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、糖耐量呈正相关（P＜0.05），见表4。

图1 lncRNA MIAT 的曲线下面积

表3 多元回归分析糖尿病患病危险因素

表4 糖尿病人外周血单核细胞中MIAT 的表达和糖尿病风险因素、血糖参数的相关性

表4（续）

3 讨论

T2DM 是一组以血糖浓度升高为特征的代谢紊乱[6]。本研究中T2DM 组lncRNA MIAT 对照组表达较增加（P＜0.05），表明lncRNA MIAT 对于T2DM 有一定的诊断价值。近年来，lncRNA 作为T2DM 的生物标志物和新的干预治疗靶点研究是新的追踪热点[7，8]。lncRNA 生物标志物在循环水平上较传统的蛋白质生物标志物更稳定，检测灵敏度更高[9，10]。可用qRT-PCR检测RNA 的微量表达，作为疾病诊断的辅助指标[11]。

心肌梗死相关转录本lncRNA MIAT 位于人22号染色体上，是T2DM 的敏感部位，MIAT 水平与T2DM 呈正相关[9]。高糖血症能够导致内皮细胞MIAT表达水平增加，STZ 诱导的糖尿病小鼠模型中MIAT和NF-κBp-p65 表达增加[12]。体外实验显示MIAT 敲除能够缓解糖尿病诱导的视网膜的新血管形成，血管渗漏和炎症[13]。本研究与既往研究结果一致，MIAT与糖尿病发病呈正相关，且进一步探讨了其相关性和诊断价值。通常根据ROC 中的AUC 数值、特异性和敏感性数值来判断检测指标是否具有诊断价值，尽管研究中MIAT 的AUC 值是0.753，但也是具有巨大潜力和价值的诊断标志物（0.7～0.8 良好；0.6～0.7有效）[14，15]。糖尿病患者外周血单核细胞中MIAT 的表达和低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血糖参数与MIAT 的表达呈正相关，且具有显著差异性，提示MIAT 的表达和脂质代谢与血糖水平密切相关。

综上所述，在疾病的病理发生中lncRNA 分子发挥着重要的作用，探讨其在疾病病理发生中的调节作用机制，对于疾病的干预和治疗有着重要的意义。对lncRNAs 的进一步研究将促进心血管疾病发病机制的认识。在这项实验研究中，探讨了MIAT 在全血样本的外周血单核细胞的表达，还未检测血清中MIAT 的表达，两者表达和作用途径是否相同有待进一步探明。PBMCS 中的lncRNA MIAT 可能是诊断AMI 的有效生物标志物，探讨其调控机制可能成为T2DM 治疗的一个潜在应用方向。