不同酶对羊血红蛋白酶解液抗氧化活性的影响

王珍如，訾 阳，杜贺阳，冯 波，高 峰，格日勒图

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018）

中国是全世界最大的羊肉生产国与消费国，2018年我国羊肉产量为475 万t[1]。羊血一般占畜禽活体重的4.0%～9.8%[2]，在我国每年可得动物血液230 万t 以上，这是一个巨大的动物蛋白资源库[3]。羊血中含有大量蛋白质、维生素、血红素、微量元素等多种活性物质，具有一定的保健功能[4]。尽管羊血来源丰富，但其在我国的利用率较低，有相当大一部分未经合理利用直接排放，造成环境污染和羊血资源的浪费[5]。

生物活性肽是一种相对分子质量介于50～10 000 Da，对机体有益或具有一定生物活性的肽类化合物[6]，具有吸收快、效率高等优点，在食品加工、饲料生产和医学等领域应用广泛[7]。其制备方法多种多样，其中酶解法成本低，生产条件温和，成为活性肽制备的常用方法之一[8]动物血液可以加工为生物活性肽而被高效利用，但将羊血开发成生物活性肽的报道较少。因此，本试验以羊血红蛋白为原料，开展羊血红蛋白酶解液体外抗氧化活性的研究，为羊血资源的深加工利用提供的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 羊血采自内蒙古省四子王旗屠宰场，过滤除杂后-20℃避光保存备用，使用前置于4℃过夜解冻；原料超声破膜处理，冷冻干燥制得羊血红蛋白粉4℃保存备用。凯氏定氮法测定其蛋白含量为90.53%。胃蛋白酶（4×105U/g）、木瓜蛋白酶（5×105U/g）、中性蛋白酶（5×105U/g）、胰蛋白酶（4×105U/g）均购于北京索莱宝科技有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.2 羊血红蛋白酶解液的制备方法 羊血3 500 r/min 离心10 min，弃上层血浆，收集下层血细胞加入等体积去离子水超声破膜30 min，冷冻干燥成粉。将血红蛋白粉与去离子水以1:5（m/v，g/mL）比例混合，试验组分别添加3%（占血粉质量）的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，对照组不加酶。参照表1 条件进行酶解5 h，每隔1 h 取一次样，沸水浴灭酶10 min，3 500 r/min 离心20 min 弃去细胞碎片及其不溶物，上清液-20℃保存，用于后续指标的测定。

表1 蛋白酶的种类及酶解条件

1.3 蛋白质含量的测定 参照王金灿[9]方法采用全自动凯式定氮仪进行蛋白质含量的测定。

1.4 氨基酸态氮含量及水解度的测定 采用甲醛电位滴定法测定氨基酸态氮含量[10]。水解度（Degree of Hydrolysis，DH）计算公式：

DH=（酶解液中氨基酸态氮含量/样品中总氮量）×100%

1.5 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力的测定 参照文飞[11]方法并稍做改动，配制0.1 mol/L DPPH 无水乙醇溶液，避光保存。取酶解液0.5 mL 加入0.5 mL DPPH 溶液于1.5 mL 离心管中混匀，室温避光反应30 min，于波长517 nm 处测定吸光度。试验设置空白组（超纯水代替样品）、对照组（无水乙醇代替DPPH 溶液）及试验组，每组设置3 个平行；DPPH 自由基清除率计算公式：

DPPH 自由基清除率=1－（Ai－Aj）/Ac×100%式中，Ai 为样品组吸光度，Aj 为对照组吸光度，Ac 为空白组吸光度。

1.6 羟自由基（.OH）清除能力的测定 采用水杨酸法[12]略做修改，取0.5 mL 酶解液、1 mL 2.3 mol/L 硫酸亚铁溶液、1 mL 2.3 mol/L 水杨酸-乙醇溶液、1 mL 2.2 mol/L 过氧化氢溶液于具塞试管中，混匀静置30 min，以超纯水为参比，于波长510 nm 处测定吸光度值（Ai）；试验设置空白组（超纯水代替样品）、对照组（蒸馏水代替硫酸亚铁溶液）及试验组，所有试验均重复测定3次；.OH 清除率计算公式：

式中，Ai 为样品组吸光度，Aj 为对照组吸光度，Ac 为空白组吸光度。

1.7 2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除能力的测定 参考文飞[11]方法略微修改，ABTS 工作液的配制：取0.007 4 mol/L 的ABTS 溶液0.2 mL 与0.002 6 mol/L 的过硫酸钾溶液0.2 mL 混匀，室温避光反应13 h 形成ABTS+工作液。使用前，先用pH=7.4 的磷酸盐缓冲液将工作液稀释40～50 倍，然后在波长734 nm 处测定其吸光度值在（0.20±0.02）。取酶解液0.2 mL 加0.8 mL ABTS+工作液，振荡摇匀10 s，室温静置6 min，于波长734 nm 处测定吸光度（A）。试验设置空白组（95%乙醇代替样品）；所有试验均重复测定3 次；ABTS+清除率计算公式：

式中，A 为样品组吸光度，A0 为空白组吸光度。

1.8 还原力的测定 参考张凤英[10]的操作方法略作修改，取酶解液0.5 mL 于试管中，加入1%wt 铁氰化钾溶液1 mL，pH=6.60 磷酸盐缓冲液1 mL，50℃水浴30 min，再加入10%wt 三氯乙酸1 mL，混匀离心（3 000 r/min，10 min），取上清液1 mL，加入1 mL 去离子水和0.1%wt三氯化铁溶液0.25 mL，混匀于50℃温育10 min，等体系颜色由淡黄色变为蓝色时混匀，以超纯水为空白对照，于波长700 nm 处测定吸光度值；所有试验平行测定3 次，吸光度值越大，表示还原力越强。

1.9 统计分析 试验数据采用Excel 2007 和SAS 9.0 一般线性模型统计分析，Duncan´s 法进行多重比较；结果以均值±标准误差表示，用Origin 2017 软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同酶处理对羊血红蛋白水解度的影响 如图1 所示，各蛋白酶对羊血红蛋白均有一定的水解能力，木瓜蛋白酶组水解度极显著高于其他组。随着酶解时间的延长，各组酶解液水解度均表现出木瓜蛋白酶组＞胃蛋白酶组＞中性蛋白酶组＞胰蛋白酶组＞空白对照组（P＜0.05）；酶解过程中，木瓜蛋白酶组、胃蛋白酶组和胰蛋白酶组水解度均呈上升趋势；中性蛋白酶组水解度于4 h 前极显著升高4 h 后则呈降低趋势；5 h 时木瓜蛋白酶组、胃蛋白酶组及胰蛋白酶组水解度均达到最大，分别为39.27%、31.03% 和10.72%，其中木瓜蛋白酶组极显著高于其他两组；空白对照组水解度维持在1%左右。

图1 不同酶对羊血红蛋白水解度的影响

2.2 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液DPPH 自由基清除能力的影响 如图2 所示，不同蛋白酶组酶解液均表现出不同的DPPH 自由基清除能力，胃蛋白酶组DPPH自由基清除能力极显著高于其他组。随着酶解时间的延长，胃蛋白酶组及中性蛋白酶组DPPH 自由基清除力均呈先增加后减少的趋势，木瓜蛋白酶组和胰蛋白酶组则呈上升趋势；3 h 前DPPH 自由基清除力呈胃蛋白酶组＞中性蛋白酶组＞木瓜蛋白酶组＞空白对照组＞胰蛋白酶组，3 h 后则表现为胃蛋白酶组＞木瓜蛋白酶组＞中性蛋白酶组＞空白对照组＞胰蛋白酶组（P＜0.01）；4 h时胃蛋白酶组清除力最大为98.06%，极显著高于其他组；2 h 时中性蛋白酶组清除力达到峰值94.62%，显著高于其他时间段，仅次于胃蛋白酶组；酶解至5 h 时，木瓜蛋白酶组、胰蛋白酶组及空白对照组DPPH 自由基清除能力达到最大分别为94.62%、32.06% 和54.57%（P＜0.05）；空白对照组DPPH 自由基的能力始终维持在50%左右。由此可见，4 种酶解产物均有清除DPPH自由基的能力，从清除DPPH 自由基角度评价胃蛋白酶是酶解羊血红蛋白产生高抗氧化活性物质的最佳用酶。

图2 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液DPPH 自由基清除能力的影响

2.3 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液对.OH 清除能力的影响 由图3 可知，各蛋白酶组均表现出一定的.OH 清除力，中性蛋白酶组.OH 清除力极显著高于其他组。各组酶在各时间段.OH 清除力均呈中性蛋白组＞胰蛋白酶组＞空白对照组＞木瓜蛋白酶组＞胃蛋白酶组（P＜0.05）；随着酶解时间的延长，中性蛋白酶组、胰蛋白酶组和胃蛋白酶组酶解液.OH 清除力均先升高后降低；而木瓜蛋白酶组呈先上升后下降最后上升的趋势；胰蛋白酶组于2 h 时清除力达到最大值90.48%且组内差异极显著；3 h时中性蛋白酶组、木瓜蛋白酶组和胃蛋白酶组.OH 清除力均达到峰值，分别为95.89%、55.64% 和46.48%（P＜0.05）；空白对照组.OH 清除力较为稳定，维持在66%左右；从.OH 清除力角度评价，中性蛋白酶是酶解羊血红蛋白产生高抗氧化活性物质的最佳用酶。

图3 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液羟自由基清除能力的影响

2.4 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液清除ABTS 自由基能力的影响 由图4 可知，随着时间的延长，各组蛋白酶酶解液均表现出一定的ABTS 自由基清除能力。2 h时中性蛋白酶组清除ABTS 自由基能力极显著高于其他组；除2 h 外，木瓜蛋白酶组清除ABTS 自由基除能力均极显著高于其他组。随着时间的延长，木瓜蛋白酶组与中性蛋白酶组均先上升后下降再略升高；胰蛋白酶组清除ABTS 自由基能力呈逐步下降的趋势；胃蛋白酶组则先上升后趋于平稳；2 h 时中性蛋白酶清除ABTS 自由基能力最大为77.21%，木瓜蛋白酶组为77.11%，两组组间差异不显著；4 h 时胃蛋白酶组清除ABTS 自由基能力达到峰值64.86%，组内差异显著；空白对照组清除ABTS 自由基能力维持在72%左右。

图4 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液清除ABTS 自由基能力的影响

2.5 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液还原力的影响 由图5 可知，随着时间的延长，各组蛋白酶酶解液均表现出较强的还原力，胃蛋白酶组还原力极显著高于其他组。酶解过程中，还原力于各时间段均呈胃蛋白酶组＞木瓜蛋白酶组＞中性蛋白酶组＞胰蛋白酶组＞空白对照组（P＜0.05）；随着酶解时间的增长，木瓜蛋白酶组和中性蛋白酶组还原力先升高后降低，4 h 时2 组还原力均达到峰值0.61，2 组组内差异极显著；胃蛋白酶组还原力先升高后降低，2 h 时还原力最大为0.96，组内差异显著；胰蛋白酶组逐步升高，5 h 还原力达到峰值0.51，组内差异显著；空白对照组还原力较平稳始终维持在0.3左右。从还原力角度评价，胃蛋白酶是酶解羊血红蛋白酶产生高抗氧化活性物质的最佳用酶。

图5 不同酶处理对羊血红蛋白酶解液还原力的影响

3 讨 论

畜禽血液作为资源丰富的工业副产品，营养价值较高，利用其制备抗氧化肽逐步成为新的应用趋势[14]。目前，酶解法是制备多肽最常用的方法，可根据不同的蛋白酶对同一蛋白源酶切位点的特异性，使其产生功能不同的多肽片段[15]；由于不同类型的蛋白酶的水解能力和作用位点不同，因此水解度及酶解产物的特性也有较大的差异[16]。本试验中各蛋白酶对羊血红蛋白均有不同程度的水解能力，其中木瓜蛋白酶组水解度最高达39.27%，极显著高于其他组。此结果表明木瓜蛋白酶水解羊血红蛋白能力较强；木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质中精氨酸和赖氨酸的羧基端，可优先水解在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键[17]，打破了羊血红蛋白天然的蛋白结构，形成了开放、暴露的氨基酸残基，增加了酶解液中疏水性氨基酸含量[13]。

抗氧化剂通过清除自由基、抑制脂质过氧化或螯合过渡金属离子达到抗氧化目的[11]，抗氧化能力并非某单一试验结果可说明，需要各指标综合考虑[18]。DPPH自由基是很稳定的、以氮为中心的自由基，常用于体外清除自由基活性评价[19]。本试验中各组蛋白酶解产物对DPPH 自由基均有一定的清除能力，其中胃蛋白酶组酶解液清除DPPH 自由基效率极显著高于其他组；3 h 前中性蛋白酶组酶解液DPPH 清除率较木瓜蛋白酶组高，仅次于胃蛋白酶组，3 h 后木瓜蛋白酶组酶解液清除率较高。此结果说明，胃蛋白组酶解液具有较强的提供质子的能力，而中性蛋白酶与木瓜蛋白酶组提供质子的能力仅次于胃蛋白酶组，质子与自由基结合后就可以阻止自由基对机体细胞的氧化损伤。Sarapultsev 等[20]研究表明，水解度与羊血红蛋白酶解液抗氧化能力也有一定关系，但并不是水解度越高抗氧化性越好，这与本研究结果一致；水解反应的终产物为氨基酸，较高的水解度使羊血红蛋白酶解过程中产生的抗氧化能力较强的短肽切断，降低了酶解液的抗氧化活性。

在正常情况下，机体代谢产生的微量活性氧（ROS）对维持细胞正常功能有一定积极作用，机体处于氧化应激状态时，机体会产生过量ROS，诱导细胞损伤、凋亡和坏死[21]；.OH 是一种氧化能力很强的活性氧自由基，对机体有很大的损伤性[22]。本试验中各蛋白酶酶解液均具有清除.OH 自由基的能力，其中中性蛋白组酶解液对.OH自由基清除效果极显著高于其他组，最佳酶解时间为3 h，与吴国宏等[13]的部分研究结果相似。本研究结果表明，中性蛋白酶除将羊血红蛋白进行水解外，还增强了酶解液中具有抗氧化活性的物质，导致.OH 自由基的清除率升高；中性蛋白酶作为肽链内切酶，水解羊血红蛋白形成氨基酸残基[23]使酶解液中能清除.OH 自由基的可溶性抗氧化多肽增加，提升了酶解液的抗氧化能力[21]。

ABTS 法是一种用于体外测定物质抗氧化能力的方法，不易受到提取物的光谱干扰，具有操作简单、快速、准确性好、精密度高等优点[24]。本试验中各组羊血红蛋白酶解液均具有清除ABTS 自由基的能力，其中2 h时中性蛋白酶组清除力最大，木瓜蛋白酶的清除力除2 h外均极显著高于其他组，表明各组蛋白酶酶解液中产生了可以高效清除ABTS 自由基的物质。ABTS 与过二硫酸钾反应后生成绿色的ABTS 自由基在734 nm 有最大吸收峰[25]，木瓜蛋白酶酶解产物对ABTS 自由基氧化速率较高，而2 h 时中性蛋白酶酶解产物对ABTS 自由基氧化速率高于木瓜蛋白酶组，证明2 h 时中性蛋白酶酶解羊血红蛋白可产生较多能与ABTS 自由基反应的小肽，导致734 nm 时吸光度降低，证明其抗氧化活性较强。

屈义等[22]研究证明，物质自身的抗氧化能力与还原力有关，可通过测定其总还原力来表示抗氧化程度的强弱。本试验中各组羊血红蛋白酶解液均有一定的还原力，其中胃蛋白酶组酶解液还原力最强，结果表明胃蛋白酶可酶解羊血红蛋白产生还原力较强的产物，进一步影响其抗氧化活性；胃蛋白酶水解的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键，可增加羊血红蛋白酶解液中还原性基团的多肽及疏水性氨基酸含量[13]。羊血红蛋白酶解物的还原能力与酶解后暴露出的氨基酸残基有关，它们可能含有侧链-OH 或能提供电子[14]。一般情况下，还原能力与抗氧化能力呈正相关，还原力越强，抗氧化能力越强[18]，因此胃蛋白酶与其他组酶相比，有较强的还原力。

4 结 论

本试验结果表明，酶解羊血红蛋白可获得具有抗氧化活性的产物，其中中性蛋白酶组羟自由基清除力及2 h对ABTS 自由基的清除力均极显著高于其他组；木瓜蛋白酶组水解度及除2 h 外对ABTS 自由基的清除力均极显著高于其他组；胃蛋白酶组DPPH 自由基清除力及还原力极显著高于其他组。综合清除自由基能力与还原力角度考虑，用中性蛋白酶酶解的羊血红蛋白酶解液具有较好抗氧化活性，可作为开发羊血抗氧化肽的工具酶。