抗菌肽的抗菌机制及其在反刍动物中应用的研究进展

■纵 瑞 胡忠泽* 张乃锋 段心明

(1.安徽科技学院动物科学学院，动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽滁州233100；2.中国农业科学院饲料研究所，北京100081；3.农发苑（浙江）农业发展有限公司，浙江湖州313000)

抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）因其独特的抗细菌、真菌、病毒以及抗癌细胞等生物学功能且不易产生耐药性，使其成为最有前景的抗生素替代品之一。从20世纪80年代瑞典科学家Hulmark从惜古比天蚕（Hyalophora cecropia）中分离出第一种抗菌肽，命名为天蚕素（Cecropin）[1]，到目前为止抗菌肽数据库中已注册的抗菌肽序列已经超过3 000个[2]。抗菌肽是包括植物、动物和人类在内的所有生物体天然免疫反应的保守部分,是许多脊椎动物免疫系统的主要组成部分[3]，被定义为能够保护宿主免受细菌、病毒或真菌入侵的关键防御分子[4]。抗菌肽是由基因编码、核糖体合成的多肽，通常具有短肽（30～60个氨基酸）、强阳离子（pI 8.9～10.7）、热稳定性（100℃,15 min）、不易产生耐药性、对真核细胞无影响等共同特征[5]。根据其来源可以分为：植物源抗菌肽，如硫素（thionins）、植物防御素(plant defensins)；动物源抗菌肽，如天蚕素、防御素；微生物源抗菌肽，如细菌素和病毒源抗菌肽；人工来源抗菌肽[6]。根据作用对象的不同可以将其分为：抗细菌类抗菌肽，如防御素（defensin）-NV、天蚕素抗菌肽（ce⁃cropin antibacterial peptide,CAP）-A；抗真菌类抗菌肽，如蜾蠃毒肽（Orancistrocerus drewseni venom pep⁃tides,OdVP）2及其类似物OdVP2L[5]；抗病毒类抗菌肽，如从金钱鱼肝脏克隆的SA-肝肽（Scatophagus ar⁃gus hepcidin,SA-Hepcidin）[7]；抗癌细胞类抗菌肽，如人β防御素（humanβ-defensin,HBD）-3[8]；抗寄生虫类抗菌肽，如蛙皮素和Cecropin[9]；根据抗菌肽的二级结构以及氨基酸组成可以分为α螺旋、β链、环状结构和延伸结构以及富含脯氨酸以及甘氨酸的抗菌肽[10]。本文将从抗菌肽发展现状、生物学功能、作用机制、在反刍动物中的应用、存在问题与发展前景等方面进行综述。

1 抗菌肽抗菌功能与机制

与作用于细胞内特定通路或受体的抗生素不同，大多数抗菌肽以细菌细胞膜为靶标，不需要特定的受体，因此不易引起细菌突变，可以抵抗细菌耐药性的产生[11]。抗菌肽对细菌的作用机制分为细胞膜损伤机制和细胞内作用机制。抗菌肽抑菌方式与细菌细胞膜的结构和性质以及抗菌肽所含的氨基酸组成有着密不可分的关系。

1.1 细胞膜损伤机制

带正电荷的抗菌肽通过静电作用与带负电荷的细菌细胞壁相接触，并优先与细菌细胞质膜中的负电荷磷脂基团如磷脂酰甘油和心磷脂相互作用，取代稳定这些磷脂基团的二价阳离子，造成膜扰动。抗菌肽利用其双亲性特性插入磷脂双分子层内，导致膜结构的改变，如膜变薄、膜曲率改变以及双分子层屏障的破坏[12]。研究表明抗菌肽的作用方式具体取决于它们的结构属性，如氨基酸序列、分子量大小、阳离子性质、疏水性和两亲性[13]。根据作用方式的不同，目前提出的4种模型：如聚集体模型（aggregate model）、环形孔模型（toroidal-pore model）、桶-板模型（barrelstave model）、毯式模型（carpet model），具体模型机制Jenssen等[14]研究已经做了详细的综述。见图1。

图1 AMPs细胞膜作用机制模型

1.2 细胞内作用机制

与大多数与细胞膜相互作用的抗菌肽不同，富含脯氨酸的抗菌肽（proline-rich AMPs,PrAMPs），如on⁃cocins-112（Onc112)和牛抗菌肽（bactenecins-7,Bac7)可以通过细菌细胞膜上的一个或多个转运体利用横跨内膜的质子电化学梯度转运到胞质中，在不溶解细胞膜的前提下通过大量的氢键堆积与细胞70s核糖体相互作用，影响生物蛋白的合成[15]；阳离子抗菌肽Mel4则通过激活细菌内部自溶酶从而诱导细菌死亡[16]；这就解释了抗菌肽浓度在较低的情况下仍有杀菌能力。

2 抗菌肽调节炎症与免疫功能的机制

炎症反应是机体天然免疫细胞（如树突状细胞以及巨噬细胞等）识别外源性物质或坏死组织等致炎因子并激发的防御性反应，然而炎症反应过度会造成机体自身损伤[17]。抗菌肽可以有效抑制生物致炎因子（如细菌、真菌、病毒等病原体）从而发挥抗炎作用，减轻炎症对机体的伤害。如鱼源抗菌肽（chionodracine,Cnd）衍生肽Cnd-m3a对多重耐药细菌有很好的抑制作用[18]；根据蛙源抗菌肽Ranacyclin AJ设计出的抗菌肽AKK8对白色念珠菌展现出较强的抗菌活性，且有效抑制了白色念珠菌感染引起的小鼠全身性炎症反应[19]；人角质形成细胞产生的抗菌肽LL-37、HBD等可以通过破坏病毒包膜以及抑制病毒与细胞表面受体结合等方式阻止病毒进入细胞或者干扰病毒在细胞内复制来抵抗病毒感染[20]；宿主防御肽（host defense peptides,HDPs）在体外表现出脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）结合活性，从而抑制THP-1细胞中核转录因子-B（nu⁃clear factor-kappa B,NF-κB）炎症信号通路的活化，减少LPS介导的促炎因子的产生[21]；而猪乳铁蛋白肽（lactoferrin peptide,LFP）-20可直接影响炎症通路中重要的衔接蛋白髓样分化因子88（myeloid differentia⁃tion factor 88,MyD88）的表达，阻断了其与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）和NF-κB依赖的信号分子间相互作用，调控LPS介导的活化巨噬细胞的炎症反应，发挥抗炎作用[22]。

趋化作用是指趋化因子控制免疫细胞定向迁移至炎症部位，是机体免疫应答发生和完成的必要条件。抗菌肽可以直接或间接诱导趋化作用，如抗菌肽KSL-W对中性粒细胞显示出微摩尔量的趋化性，并且能够诱导中性粒细胞中的肌动蛋白聚合[23]；而先天防御调节肽（innate defense regulator,IDR）和HDPs通过诱导趋化因子的产生进而对中性粒细胞和单核细胞起到间接趋化作用[24]。淋巴细胞增殖是衡量机体免疫能力的一个重要指标，在仔猪日粮中添加抗菌肽加强T淋巴细胞的增殖功能，降低凋亡细胞的百分率，明显改善断奶仔猪细胞免疫[25]。天蚕杆菌肽显著提高了肉鸡新城疫抗体水平和T淋巴细胞转化率，有效增强机体免疫力[26]。抗菌肽还可提高血清补体C4（complement-4,C4）的含量以增强免疫功能[27]。

3 抗菌肽对机体屏障的作用与机制

大量研究证实抗菌肽对屏障组织具有很好的调控作用。Otvos等[28]研究发现LFP能够调节炎症反应、改善角质形成细胞功能、促进伤口再上皮化以及成纤维细胞的增殖和迁移，人源抗菌肽LL-37同样具有类似的作用。肠道屏障功能主要由调节黏蛋白和紧密连接蛋白共同维持[29]，紧密连接蛋白是肠道物理性屏障的基础。外源添加抗菌肽LL-37重建了鼠伤寒沙门氏菌破坏的结肠T84细胞紧密连接中闭合小环蛋白-1（zonula occludens proteins-1,ZO-1）的网状模式[30]。而有些抗菌肽却加大了紧密连接和细胞质膜的通透性，研究人员通过分子模拟确定了紧密连接蛋白claudins为抗菌肽PN159潜在作用靶点，发现PN159通过与claudin-4和claudin-7保守氨基酸残基相互作用打开了细胞旁通路，安全且可逆地增强了Caco-2肠屏障模型的通透性，并发现其还具有增强细胞膜通透性以及抗菌功能[31]。

4 抗菌肽在反刍动物中的应用进展

反刍动物的瘤胃里面生活着大量微生物，抗菌肽可通过作用于细菌、原虫、古菌以及真菌等微生物，从而对瘤胃发酵产生重要影响。抗菌肽通过与古菌细胞壁相互作用或与其细胞内遗传物质相结合的方式对古菌产生抑制作用，减少甲烷气体的产生[32]。牛链球菌细菌素Bovicin HC5可以抑制瘤胃古菌，减少近50%甲烷的产生[33]。乳酸链球菌素(Nisin)在抑制甲烷产生、调节瘤胃微生物菌群，降低瘤胃乙丙酸比值方面较莫能菌素具有更大的优势[34]。Liu等[35]在山羊精料中添加抗菌肽影响了瘤胃中微生物多样性及纤毛虫的群落结构，并对幼山羊的生长性能、瘤胃发酵功能、酶活性和瘤胃形态均有一定的促进作用。Ren等[36]研究发现，添加抗菌肽调节了山羊瘤胃微生物结构，从而影响了瘤胃总挥发性脂肪酸（total volatile fatty acid,TVFA）的浓度及消化酶的组成，提高了饲料利用率，改善了山羊的生长性能。陈亚迎[37]在湖羊日粮中添加Nisin和溶菌酶降低了瘤胃中高效产氨菌（hyper ammonia-producing bacteria,HAB），减少了氨氮的生成，增加了氮沉积，并降低了古菌的相对丰度，提高了能量利用率，促进了湖羊的生长。李世易[38]通过在湖羊日粮中添加蜂蜜肽增加了湖羊的日采食量、平均日增重和饲料转化率，抑制了瘤胃革兰氏阴性菌，调节瘤胃发酵，提高了育肥湖羊的生产性能。

研究表明，抗菌肽可以通过间接机制为机体提供保护，它们不仅仅可以杀死微生物，还可以作为免疫调节剂，改变宿主基因的表达，或者作为趋化因子以及诱导趋化因子的产生抑制促炎细胞因子的分泌，并调节T淋巴细胞对适应性免疫反应的反应[39]。杨颜铱[40]在山羊日粮中添加高精料和抗菌肽促进了血清中免疫球蛋白，促炎因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-12的分泌，提高了血清中补体的含量以及淋巴细胞的转化率和红细胞免疫，增强了山羊的体液免疫和细胞免疫。陈憧[41]研究表明，山羊日粮中添加复合抗菌肽增强了山羊的红细胞免疫，提高了血清中免疫球蛋白含量，并对山羊的抗氧化能力也有显著提升。秦龙[42]研究发现，在羔羊日粮中添加抗菌肽提高了血清中免疫球蛋白含量，并降低了羔羊肝脏组织中炎症基因IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor ne⁃crosis factor,TNF）-α和干扰素（interferon,IFN）-γ的表达，有助于羔羊免疫系统的建立。

抗菌肽对动物肠道屏障的影响主要集中于仔猪[43]和家禽[44]方面，而关于抗菌肽对反刍动物肠道屏障的研究很少见报道。由于食管沟反射，反刍动物哺乳期采食乳汁直接由食管进入瓣胃，主要在皱胃和小肠内消化吸收[45]，因此在羔羊日粮中添加抗菌肽效果与哺乳仔猪类似。秦龙[42]在羔羊日粮中添加人工合成抗菌肽CC31改善了肠道组织形态结构，肠道上皮紧密连接蛋白基因表达量也相对上调，另外提高了肠道菌群的丰富性和多样性，促进了有益菌群的定植，抑制了有害菌的增殖，增强了肠道屏障，有利于羔羊的健康。

国内外对抗菌肽替代抗生素治疗乳房炎等疾病方面也进行了大量的研究，Maina等[46]报道枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌产生的细菌素有较好的稳定性，对奶牛乳房炎病原菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。丁酸钠可以通过组蛋白去乙酰化、NF-κB途径等影响牛乳腺上皮细胞内源性抗菌肽的基因表达，进而在金黄色葡萄球菌感染和脂磷壁酸（lipotei⁃choic acid,LTA）刺激的牛乳腺上皮细胞中发挥抑菌抗炎作用[47]。研究发现真菌防御素plectasin的衍生肽NZ2114针对乳房炎病原菌无乳链球菌相比于抗生素有更好的杀菌活性，且对无乳链球菌生成的生物膜有很好的抑制作用；另外通过金黄色葡萄球菌体外抑菌试验发现其可以作用于细胞膜以及胞内脱氧核糖核酸（deoxyribo-nucleic acid,DNA），降低细菌的耐药性并消除耐药基因[48-49]。抗菌肽还可以提高隐形乳房炎奶牛的产奶量、乳品质、降低牛奶中体细胞数，提高隐形乳房炎治愈率[50]。有研究证实牛抗菌肽NK-lysin衍生肽对睡眠嗜血杆菌以及牛支原体等多种牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex,BRDC）致病菌表现出抗菌活性[51-52]。

5 抗菌肽应用的影响因素

5.1 安全性问题

有研究发现静脉注射抗菌肽会对肾脏和神经产生毒副作用，另外有些抗菌肽在杀菌的同时具有溶血性。研究人员发现取代彼得异蝎肽Hp1404 N端的第一个氨基酸残基设计的衍生肽K1K8，极大地降低了其溶血性[53]。真核细胞表面不带电荷，因此抗菌肽只能依靠两亲性与细胞相结合，研究发现可以通过破坏抗菌肽的两亲性从而减少抗菌肽与真核细胞间发挥作用，以此减少细胞毒性[54]。

5.2 稳定性问题

天然抗菌肽稳定性的问题制约着其在实际生产中的应用。研究人员通过将黄蜂Polybiapadista毒液中提取的抗菌肽Polybia-MPI中所有的L-氨基酸用非天然D-氨基酸替换，由于空间构型上的差异，使蛋白酶无法水解D-氨基酸构成的肽键[55]，或者通过构建抗菌肽递送载体的方式[56]提高了抗菌肽的蛋白酶稳定性。罗文杰等[57]通过截取天然抗菌肽N端氨基酸残基，并进行固相合成，证明其在100℃以及在不同盐浓度以及酸碱度（pH）条件下均可保持抗菌活性。

5.3 来源问题

抗菌肽最初来源于生物体内的天然抗菌肽，但是产量较低且分离困难；化学合成方法成本较高，且难以保持其空间结构从而影响其生物学活性；基因工程重组蛋白表达因其产量较高成为目前较为主流的生产抗菌肽的方法，因其后期产物难以获得纯品而受到限制，但是可以通过优化反应条件，并采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱等技术对重组蛋白进行纯化，进而获得高效产出并且纯度高的抗菌肽[58]。

5.4 抗菌活性问题

抗菌肽对比抗生素在抗菌活力和抗菌谱方面还是存在差距。有研究表明，抗菌肽的抗菌效价与其所带电荷数有关，如Gong等[59]用带正电荷的赖氨酸取代了皮抑菌肽Dermaseptin-AC亲水性表面的不带电荷的丙氨酸，降低了其最小抑菌浓度。但当正电荷增加到一定值后导致抗菌肽之间的静电斥力大于抗菌肽与细胞膜表面的吸引力，从而抑制抗菌肽与细胞膜的结合，导致抗菌能力下降[60]。此外螺旋结构可以促进抗菌肽插入细菌细胞膜，研究人员发现CAP-A的N端两亲性α-螺旋片段与LL-37的核心抗菌片段相结合设计出具有更多正电荷和更高螺旋结构含量的杂交肽，从而提高了抗菌肽的抗菌活力并降低了溶血性[61]。

5.5 耐药性的问题

细菌会修饰其细胞壁成分，以减少其表面的净负电荷。细菌细胞壁的荚膜多糖也可以起到屏蔽作用，阻碍微生物表面与抗菌肽的相互作用。有些细菌可以通过下调机体抗菌肽基因表达，促进细菌的黏附和侵袭。还有些细菌分泌降解抗菌肽的肽酶和蛋白酶，从而抑制抗菌肽的抗菌活性，线性肽是这些酶的主要靶标[62]。生物被膜也是细菌产生抗药性的主要原因。抗菌肽的电荷、疏水性和构象等理化性质在抗菌活性和生物体选择性方面起着重要作用。

6 前景展望

抗菌肽因其独特的抑菌机制，使得细菌不易对其产生耐药性，并且对抗生素耐药型菌也展现出良好的抑菌效果，有希望成为抗生素理想替代品。抗菌肽屏障修复和免疫调节功能使其具有良好的促生长和抗病能力。作为一种多肽产物，抗菌肽容易被机体代谢，不易在动物产品中残留等一系列优势将在推动畜牧业健康可持续发展发挥重要作用。基因工程技术结合适当的表达体系、完善的表达策略和分离纯化技术，使得抗菌肽高效低成本的生产成为可能。氨基酸替换、环化、包埋，抗菌肽修饰等技术提高了抗菌肽的安全性以及稳定性。随着对抗菌肽作用机制和构效关系研究不断深入以及细菌耐药性发生机制的了解，有针对性地对抗菌肽结构进行改造，将极大提高抗菌肽的抗菌活性。在无抗养殖的大趋势下，国内外已有相关企业对抗菌肽产品进行推广和研究，应用效果也得到证实，但抗菌肽产品的发展成熟仍需科研人员与生产企业进一步合作探索，以便在未来替代抗生素的使用中发挥巨大作用。