无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物HS-SPME萃取条件优化与应用

刘兴丽，丁江涛，何基宏，沈力，尚紫博，冯志强，木泰华，张华

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；

2.三全食品股份有限公司，河南 郑州 450000；

3.中国农业科学院 农产品加工研究所，北京 100193

0 引言

麸质即面筋蛋白，主要包括麦谷蛋白和醇溶蛋白.部分人群对小麦粉麸质不耐受，易引发自身免疫疾病，常见的如乳糜泻(Celiac Disease，CD)，这大约影响到0.2%～1%的世界人口[1].目前，长期食用无麸质食品(Gluten-free Food，GFF)是能有效解决麸质不耐受问题的方法之一[2].

马铃薯作为世界第四大主食，在日常饮食中的占比逐渐增大.马铃薯除含有淀粉和蛋白质外，还含有一些有利于人体健康的植物化学物质，如酚类、黄酮类、多胺类及类胡萝卜素[3]，且在较低温度和大气压下蒸制不会形成丙烯酰胺[4].此外，马铃薯蛋白的营养指数可与鸡蛋蛋白相媲美，具有安全和非过敏性的优点，可用于纯素食和无麸质饮食的制作.馒头营养健康、食用方便，是我国传统主食之一.以马铃薯为原料制作的无麸质马铃薯馒头缺乏面筋蛋白，面团内部不易形成有效的网络结构，使得馒头易塌陷、品质劣、风味差，目前大部分研究多关注无麸质马铃薯馒头理化品质的提高，而对无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物检测方法的研究鲜有报道[5].

顶空固相微萃取(HS-SPME)是一种简便、低成本、无溶剂、较灵敏的风味化合物分析技术，适用于宽沸点范围的挥发性风味化合物的分析，该技术已广泛用于多种食品挥发性化合物的测定.影响HS-SPME效果的因素有萃取头、萃取时间、萃取温度、样品量等[6].基于此，本研究拟以无麸质马铃薯馒头为研究对象，利用响应面法优化其挥发性风味化合物的 HS-SPME 萃取条件，并结合气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术，检测无麸质马铃薯馒头制作过程中挥发性风味化合物的变化，分析其变化规律，以期改善无麸质马铃薯馒头的弱香气，为无麸质发酵制品的进一步开发与研究提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

新鲜马铃薯(品种：Shepody)，中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供；酵母，安琪酵母有限公司产；黄原胶，河南金诚生物科技有限公司产；蛋清蛋白，蛋白质质量分数为84.3%(如无特指，文中百分数均为质量分数)，河北同和生物制品有限公司产；海藻糖，广州亿宝莱生物科技有限公司产.以上试剂均为食品级.

1.2 主要仪器与设备

BG2-70型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产；5KSM150PS型搅拌机，美国KitchenAid公司产；Agilent7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司产；DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)、PDMS/DVB (65 μm)、PDMS(65 μm)、PEG(60 mm)4种萃取头，美国Supelco公司产.

1.3 实验方法

1.3.1 马铃薯粉的制备将马铃薯削皮、洗涤、切片，浸泡于体积分数为0.5%的柠檬酸护色液中30 min，于50 ℃干燥箱中烘干后，研磨成粉，过100 μm筛，得到粒径均匀的马铃薯粉.该马铃薯粉中的淀粉、蛋白质、脂肪、膳食纤维和灰分的质量分数分别为68.78%、9.97%、1.43%、6.08%和0.26%.

1.3.2 无麸质马铃薯馒头的制作根据A.Y.Aregbe[7]的方法制备无麸质马铃薯馒头，并稍作修改.无麸质马铃薯馒头由马铃薯粉和以马铃薯粉为基础的4.84%预糊化马铃薯粉、1.68% 黄原胶、5.87%蛋清蛋白、69.69%水、1.00%酵母和0.50%海藻糖组成.在混合面团之前，将酵母预溶于30 ℃温水中，静置10 min.在搅拌机中以2档转速混合上述成分10 min，然后将面团分成每份100 g，在温度30 ℃、相对湿度85%的恒温恒湿箱中发酵60 min后取出，整形，于蒸锅中蒸制30 min，即得无麸质马铃薯馒头.

1.3.3 不同萃取头对无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物检测的影响采用HS-SPME技术萃取无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物，采用GC-MS技术检测4种不同萃取头萃取的无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物.

HS-SPME条件：取2 g样品放入12 mL顶空瓶中，于60 ℃条件下水浴20 min，将4种萃取头于进样口270 ℃活化30 min后，插入顶空瓶并保持在样品上方10 mm，萃取60 min；萃取结束后，手动进样，进样口250 ℃解吸3 min.

GC条件：HP-5毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，载气为He，恒定流量为1.3 mL/min；升温程序为起始温度40 ℃保持3.5 min，以5 ℃/min的速率升到90 ℃，再以12 ℃/min的速率升到220 ℃，保持7 min，最后以 20 ℃/min 的速率升到245 ℃，保持3 min；进样口温度为250 ℃.

MS条件：采用全扫描模式采集信号，电离方式为EI，发射电流为200 μA，电子轰击能量为72 eV，接口温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，质谱扫描范围(m/z)为33～495 amu.

1.3.4 响应面优化试验设计采用响应面法对无麸质马铃薯馒头的HS-SPME萃取条件进行优化，评价样品质量(X1)，萃取时间(X2)和萃取温度(X3)3个HS-SPME参数对挥发性风味化合物萃取效果的影响.基于三因素中心复合设计(Central Composite Design,CCD)，共设计20种优化方式.采用以下方程式得到编码值和未编码值之间的对应关系：

xi=(Xi-X0)/ΔXi

式中，xi是变量的编码值，Xi是变量的实际值，X0是Xi在中心点的实际值，ΔXi是阶跃变化值.

响应面自变量因素编码和水平见表1.

表1 响应面自变量因素编码和水平表

整个设计共20个试验，包括14个阶乘试验和6个中心点的重复试验.所有试验均随机进行，以尽量减少系统误差造成结果中无法解释的变化.试验结果符合以下回归方程[8]：

式中，Y是预测的响应值，β0是模型常数，β1、β2、β3是线性项常数，β11、β22、β33是平方项常数，β12、β13、β23是相互作用项常数，X1、X2、X3是自变量.

方差分析可给出回归模型的拟合优度和参数估计的显著性.使用Design-Expert Version 8进行模型生成、模型适当性测试和等高线图的生成.以挥发性风味化合物的总峰数和单位质量样品的峰面积为响应值，确定最佳HS-SPME萃取条件.

1.3.5 无麸质马铃薯馒头制作过程中挥发性风味化合物的变化在最佳HS-SPME萃取条件的基础上，进一步研究不同样品(马铃薯粉(F)、无麸质马铃薯面团(D)、20 min发酵面团(F20)、40 min发酵面团(F40)、60 min发酵面团(F60)、10 min蒸制面团(H10)、20 min蒸制面团(H20)、30 min蒸制面团(H30))中的挥发性风味化合物，了解从马铃薯粉到无麸质马铃薯馒头蒸制过程中的挥发性风味化合物变化，以改善无麸质马铃薯馒头的弱香气.

1.3.6 数据处理与分析上述实验均重复进行3次，结果以(平均值±标准差)表示.使用SPSS和Origin8.5软件进行数据分析并作图，单因素方差分析通过Duncan多重比较法进行显著性检验(P<0.05).挥发性风味化合物经计算机检索并同时与其本身数据库NIST11.LIB进行匹配，仅研究匹配度大于80的挥发性风味化合物，同时采用面积归一法对其进行定量分析.

2 结果与分析

2.1 不同萃取头对无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物检测的影响分析

由于极性不同，HS-SPME萃取头的类型对挥发性风味化合物的萃取效果不同，因此其对HS-SPME的分析结果至关重要.无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物的GC-MS分析图如图1所示.由图1可以看出，不同萃取头对无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物均有显著影响.不同萃取头对挥发性风味化合物的总峰数和单位质量样品峰面积的影响如图2所示.由图2可以看出，对挥发性风味化合物的总峰数而言，使用DVB/CAR/PDMS萃取头得到的色谱总峰数最多(为28个)，其次是PDMS/DVB萃取头(为19个)、PDMS萃取头(为10个)和PEG萃取头(为6个)；对单位质量样品的峰面积而言，PDMS/DVB萃取头得到的单位质量样品的峰面积最大(为3.14×107)，其次是DVB/CAR/PDMS萃取头(为2.31×107)、PEG萃取头(为2.48×106)和PDMS萃取头(为2.40×106).

图1 无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物的GC-MS分析图

图2 不同萃取头对挥发性风味化合物总峰数和单位质量样品峰面积的影响

不同极性的萃取头会影响挥发性风味化合物的萃取，如CAR/PDMS可以更好地萃取早期洗脱的风味化合物和吡嗪，而DVB/CAR/PDMS可以更好地萃取大多数亲水性风味化合物(如呋喃和吡喃衍生物)[9].DVB/CAR/PDMS萃取头所萃取的挥发性风味化合物具有较多的峰数，且其对无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物较敏感.因此，DVB/CAR/PDMS萃取头适用于无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物的萃取，这与C.W.Ho等[10]的研究结果一致.综上所述，对于无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物萃取条件的响应面优化使用DVB/CAR/PDMS萃取头.

2.2 响应面优化试验结果分析

响应面优化的设计方案和试验结果见表2.

表2 响应面优化的设计方案和试验结果

由表2可得在设计点的挥发性风味化合物总峰数(Y1)和单位质量样品峰面积(Y2)的试验值，应用响应面回归分析后，预测模型由以下二次多项回归方程表示.

Y1=-21.563 64+3.045 45X1+0.372 27X2+1.361 21X3+0.025X1X2+0.066 667X1X3+6.666 67×10-3X2X3-0.636 36X12-6.590 91×10-3X22-0.018 384X32

Y2=-9.511 42×107+7.327 23×107X1-2.427 18×106X2+5.267 17×106X3-940 69.375X1X2+61 425.833 33X1X3+13 112.125X2X3-1.824 95×107X12+29 900.045 45X22-62 480.363 64X32

回归模型的方差分析见表3.响应面试验设计方差分析中的P值和构建模型中的变量系数可以反映变量对响应指标的影响程度，P值越小、系数越大，相应变量对响应指标的影响越大[11].由表3可知，Y1的预测系数R2值为0.962 7，表明Y1总变化中的96.27%归因于自变量；Y2的预测系数R2值为0.979 0，表明该模型预测的单位质量样品峰面积与实验数据一致性很高.Y1和Y2两个模型的失拟项均不显著，表明两个模型均拟合良好.挥发性风味化合物总峰数的回归系数分析结果表明，对挥发性风味化合物影响最大的变量是X1，其次是X2，X32，X2X3，X3，X22，影响均非常显著(P<0.01)；X1X3的相互作用项影响显著(P<0.05)；其他项(X1X2和X12)影响均不显著(P>0.05).而单位质量样品峰面积的回归系数分析结果表明，对挥发性风味化合物影响最大的变量是X2，其次是X3，X12，X22，X32，X2X3，影响均极显著(P<0.001)；X1X2的相互作用项影响显著(P<0.05)；其他项(X1X3和X1)则影响均不显著(P>0.05).

表3 回归模型的方差分析

2.3 响应面模型与等高线图分析

2.3.1 挥发性风味化合物总峰数变量之间的交互作用分析响应面等高线图由回归方程的图形表示，可用于反映两个变量的交互作用，而将其他自变量均保持在零编码级别[12].不同HS-SPME参数对挥发性风味化合物总峰数交互作用的等高线图如图3所示.由图3a)可以看出，当萃取温度固定为0时，随着样品质量和萃取时间的增加，总峰数在较低范围内增加，而在较高范围内减少.这表明，在样品质量较小且萃取时间较短的情况下，某些目标风味化合物难以被检测.但在样品质量较大或萃取时间较长的情况下观察到了相反过程，这可能是由于萃取头的吸附位点被高挥发性风味化合物所取代，且使这些化合物的浓度增加.由图3b)可以看出，当萃取时间固定为0时，随着样品质量和萃取温度的增加，总峰数由22个增加到34个，在高温下尤为明显.萃取温度是提高萃取率的一个重要参数，有助于将样品中的被分析物释放到顶空中.一般来说，加热能够为被分析物的分子提供能量，克服使其与基质相连的能量屏障，增强传质过程，增加被分析物的蒸汽压力，从而促进被分析物释放到顶空中[13].由图3c) 可以看出，当样品质量固定为0时，萃取时间和萃取温度对挥发性风味化合物总峰数的交互作用类似于图3b).在一定范围内，总峰数随萃取时间和萃取温度的增加而增加，这可能是由于萃取时间和萃取温度可影响挥发性风味化合物的释放量，但当萃取时间和萃取温度继续增加时，萃取头吸附被分析物的能力会降低.因此，应平衡HS-SPME参数及萃取头的吸附能力，以达到最佳的萃取效果[14].

图3 不同HS-SPME参数对挥发性风味化合物总峰数交互作用的等高线图

2.3.2 单位质量样品峰面积变量之间的交互作用分析不同HS-SPME参数对单位质量样品峰面积交互作用的等高线图如图4所示.由图4a)可以看出，当萃取温度固定为0时，随着样品质量和萃取时间的增加，单位质量样品峰面积在较低范围内迅速增加，但随两参数的进一步增加而下降.这可能是因为较大的样品质量和较长的萃取时间有利于分析物分子占据纤维上更多的位点，然而，当所有位置均被占据后，样品质量和萃取时间的增加将不再影响萃取效率，有时还会导致解吸.该研究结果与X.C.Song等[15]的研究结果一致.由图4b)可以看出，当萃取时间固定为0时，在较低范围内，随着样品质量和萃取温度的增加，单位质量样品峰面积从3.13×107增至7.74×107.然而，萃取头对挥发性风味化合物的吸附在一定条件下是饱和的，较大的样品质量和萃取温度可能导致一些挥发性风味化合物的损失.由图4c)可以看出，当样品质量固定为0时，萃取时间和萃取温度对单位质量样品峰面积的交互作用与图4a)相似.因此，需要平衡HS-SPME参数，以达到最佳的萃取效果.

图4 不同HS-SPME参数对单位质量样品峰面积交互作用的等高线图

2.4 验证实验结果分析

为了获得最大挥发性风味化合物总峰数和单位质量样品峰面积，使用RSM的Design-Expert 软件对模型进行了优化.最佳HS-SPME萃取条件确定为：样品质量2.42 g，萃取时间 60 min，萃取温度50 ℃.在此条件下，挥发性风味化合物总峰数和单位质量样品峰面积分别为38个和7.75×107，与模型的预测值(分别为36个和7.65×107)吻合，验证了该模型的有效性和实用性.

2.5 无麸质马铃薯馒头制作过程中挥发性风味化合物变化分析

馒头的香气是影响顾客选择的主要指标之一.原料配方的成分会影响馒头的香气，当使用无麸质面粉制作馒头时，所产生的香气要比小麦粉或黑麦粉馒头弱[16].馒头香气的形成不仅取决于原料配方，还取决于和面、发酵、蒸煮等制作条件[17].因此，在最佳HS-SPME萃取条件下，笔者进一步研究了无麸质马铃薯馒头制作过程中挥发性风味化合物的变化,结果如表4所示.由表4可知，在无麸质马铃薯馒头制作过程中，共检测到69种挥发性风味化合物.在马铃薯粉中共发现11种挥发性风味化合物，其中，壬醛、1-辛烯-3-醇和己醛是马铃薯粉的主要香气成分，但1-辛烯-3-醇对无麸质马铃薯馒头的香气有负面影响.在和面过程中，挥发性风味化合物的数量增至21种，这可能是因为酶促反应增加了产生挥发性风味化合物的底物[18].在发酵20 min时，产生了乙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-丙醇和酯类物质.这些挥发性风味化合物在温和发酵中产生，并随着发酵时间的延长，其数量显著增加，特别是醇类、酸类和酯类化合物，这将改善馒头的香气.此外，随着酯类化合物的增加，醇类和酸类化合物含量降低，这主要是因为发酵过程产生的醇类与酸类化合物相互作用产生了酯类化合物.在蒸制过程中，一些挥发性风味化合物由于沸点较低，会因蒸发而出现减少或消失的现象.吡嗪类化合物的数量在蒸制过程中显著增加，这一结果与B.Rega等[9]的研究结果一致.此外，与无麸质玉米淀粉面团及其馒头相比，本研究发现了更多的酯类和醇类化合物[19-20].

表4 无麸质马铃薯馒头制作过程中挥发性风味化合物的变化

表4(续)

3 结论

本文以无麸质马铃薯馒头为研究对象，研究了不同萃取头对无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物检测的影响，发现DVB/CAR/PDMS萃取头适用于无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物的萃取.对顶空固相微萃取(HS-SPME)过程中的样品质量、萃取时间和萃取温度3个主要参数进行了响应面优化，得到最佳HS-SPME萃取条件为样品质量2.42 g，萃取时间60 min，萃取温度50 ℃，该条件下挥发性风味化合物总峰数和单位质量样品峰面积分别为38个和7.75×107.基于最佳HS-SPME萃取条件，进一步研究了无麸质马铃薯馒头制作过程中挥发性风味化合物的变化，发现在无麸质马铃薯粉馒头制作过程中，共检测到69种挥发性风味化合物，且随着发酵时间的延长，挥发性风味化合物的数量显著增加，特别是醇类、酸类和酯类化合物，此外，吡嗪类化合物的数量在蒸制过程中显著增加.本文优化后的HS-SPME萃取条件为无麸质马铃薯馒头挥发性风味化合物的定性检测提供了一种可行方法，但HS-SPME技术不适用于挥发性风味化合物的定量检测.因此，动态顶空、在线监测等新方法尚有待进一步研究.此外，为提高无麸质食品的品质，适宜的制作方法、时间、温度、菌种等因素对挥发性风味化合物的影响也有待进一步的研究.