蚯蚓顶体效应及其在土壤健康质量诊断中的应用研究

熊张平，周世萍，杨广斌，解思达，朱鑫泽

西南地区林业生物质资源高效利用国家林业与草原局重点实验室(西南林业大学)，昆明 650224

生物标志物是衡量环境污染物的暴露及效应的生物反应，被广泛用于土壤污染的生态毒理学诊断及评价[1-2]。蚯蚓作为土壤环境污染的重要指示生物[3-5]，在受到外源污染物影响时，其在分子、细胞和生理水平上都会发生明显的变化，进而会对蚯蚓个体的存活、生长和繁殖等产生影响[6]，这些不同功能层次的生物反应可以作为生物标志物应用于土壤污染的生态毒理学诊断[7-9]。

生殖系统是蚯蚓的敏感系统，与蚯蚓生殖系统相关的生物标志物不仅可以灵敏地反映污染物对蚯蚓的生殖毒性影响，而且对可能产生的生态风险具有重要的指示性[10]。目前用于污染物土壤生态风险评价的蚯蚓生物标志物主要有：个体及种群水平的生物标志物、细胞水平的生物标志物、生物酶蛋白标志物、暴露和生物效应标志物[11-13]。与生殖毒性相关的生物标志物主要是产卵数量、卵孵化率等个体及种群水平的生物标志物[11]，这些标志物虽能直观、真实地反映污染物对蚯蚓个体及种群的生殖毒性影响，但这些指标一般需要较长的暴露时间才能检测，如产卵量和卵孵化率等指标需要28 d甚至更长时间才能检出，难以满足农田土壤健康质量快速诊断和评价的实际需求[14]。

顶体反应是生物受精过程中极其重要的环节，是获能精子在穿越卵丘细胞与透明带之前或穿透这些结构期间，精子被激活后释放顶体内容物，溶解卵丘细胞和透明带，进而穿过透明带与卵细胞融合完成受精的过程，只有发生顶体反应的精子才能与卵子结合[15-17]。精子顶体酶是参与顶体反应的重要酶类物质之一，此酶能水解卵细胞的透明带糖蛋白，使精子能够与卵子融合[18-19]，还能够促进生殖系统中的激肽释放，从而增强精子的活力和促进精子的运动，是顶体反应能否成功的关键[17]。精子质量是受精的前提，也是生殖功能是否正常的重要标志，近年来研究证实精子顶体酶与精子密度、精子质量和受精率之间呈显著正相关[20]，因此顶体酶活性不仅可以反映精子质量的变化，同时对生殖功能的变化也具有指示作用，是较有希望用于污染物生殖毒性及生态风险的监测评价指标。

目前蚯蚓与生殖毒性相关的生物标志物中，缺乏可以灵敏快速反映污染物生殖毒性的监测指标。如果蚯蚓受精过程中也存在精子顶体反应，就可以利用蚯蚓精子顶体酶的活性变化对土壤污染物的生殖毒性进行监测，从而对污染物的生态风险进行评价和预警，但目前已有的动物顶体反应研究主要涉及哺乳动物，对于蚯蚓等土壤生物的研究还未见报道。为此，本研究对蚯蚓精子的顶体反应进行了研究，采用考马斯亮蓝染色法[21-25]验证对蚯蚓精子的顶体率进行检测，在此基础上，通过响应面法对顶体酶活性测定条件进行优化，建立了蚯蚓精子的顶体酶活性测定方法，希望该方法能够应用于土壤污染物生殖毒性的快速诊断，为土壤污染的生态风险监测及早期预警提供可行的监测指标及其测定方法。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 蚯蚓

供试蚯蚓为云南哀牢山地区采集的皮质远盲蚓(Amynthascorticis)，培养条件为：土壤含水量为田间最大持水量的50%，温度20 ℃；实验蚯蚓选用2～3月龄，体重0.4～0.5 g，具有成熟环带的健康蚯蚓。实验前将蚯蚓在供试土壤中适应1周后取出，用纯水冲洗放入铺有湿润灭菌纱布的玻璃皿中，恒温(20±2) ℃暗室培养24 h，进行清肠处理备用[26-28]。

1.1.2 供试土壤

本实验选取人工土作为培养基质，按照经济合作与发展组织(OECD)规定的人工土标准配制，其组成成分为：石英砂70%，高岭土20%，苔藓草碳土10%，以碳酸钙调节pH为6.0±0.5[13]。

1.1.3 试剂

乙醇脱氢酶(ADH)，比活力是300 U·mg-1，优级纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；氧化型辅酶Ⅰ (NAD)，优级纯，购自北京索莱宝科技有限公司；苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE)，优级纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；复方醋酸棉酚片购自西安北方药业有限公司。其他药品均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 仪器设备

紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司，UV-1950)；倒置荧光显微镜(德国Carl Zeiss公司，Axiovert 200)；智能高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司，3H20RI)；电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司，YLD-300)；电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司，DK-98-Ⅱ)。

1.2 蚯蚓顶体反应检测

参考考马斯亮蓝染色法[21-25]并改良，用于观察检测蚯蚓精子顶体反应。即蚯蚓用清水浸泡，洗去泥沙污物等，放在滤纸上吸干，70%乙醇麻醉，冰浴的条件下，按组织结构进行解剖，取出储精囊，放入盛有1 mL磷酸缓冲液或生理盐水的离心管中。眼科剪剪碎储精囊，4 000 r·min-1条件下离心3 min，弃掉上清液，沉淀以1 mL 4%多聚甲醛溶液悬浮固定10 min，4 000 r·min-1条件下离心3 min，弃上清液，1 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)，洗涤1次；适量PBS悬浮沉淀，吸取适量精子悬液涂片晾干；精子涂片入染色缸，浸染20 min，水冲洗玻片，晾干备检[24]。在显微镜下，对蚯蚓精子的染色形态进行拍照，镜检计数>200个精子，记录顶体率[29]。

1.3 蚯蚓顶体酶测定方法的建立

目前测定精子顶体酶的方法主要有明胶分解试验方法[30]、精氨酸酰胺酶活性检测法[31]和BAEE/ADH联合检测法等[32-33]，BAEE/ADH联合测定法是目前检测精子顶体酶常用方法，已用于对猪和人等物种精子顶体酶活性的测定，但由于蚯蚓的品种特性，跟其他动物存在种属差异，已报道的BAEE/ADH联合测定法不能有效检测出蚯蚓顶体酶活性，需针对蚯蚓物种特性对顶体酶测定方法进行优化改进。笔者采用响应面分析法对蚯蚓精子顶体酶活性测定方法进行优化，以确保测定方法的高效、低成本，便于推广和应用。对测定方法影响最显著的洗涤次数、ADH浓度、NAD浓度和抽提时间进行四因素五水平正交组合实验，因素水平表如表1所示。

表1 实验因素水平表

1.4 方法学考察

棉酚作为非激素类干扰生精的代表药物，研究证明，醋酸棉酚可抑制大鼠和人精子的数目、活率和活力[34-35]。因此利用醋酸棉酚对测定方法进行方法学考察。参考急性毒性实验方法[36]，在蚯蚓未表现出回避反应的浓度范围内设置6个浓度梯度，染毒浓度梯度(0、4、8、12、16和20 mg·kg-1)。实验时，每个浓度剂量处理组设置4个重复。称取300 g人工土于500 mL培养瓶中，将所需药剂与人工土充分混匀[37]，调节水分，然后各放入10条健康的蚯蚓，用保鲜膜(解剖针扎孔)密封，橡皮筋扎住，置于(20±1) ℃培养箱中，进行12 h光照、12 h黑暗培养。

顶体酶活性的测定方法采用本研究建立的方法。于染毒处理后第3天取出蚯蚓，按其组织结构对其进行解剖，取出储精囊，称其质量。用1 mL 0.15 mol·L-1NaCl制成组织匀浆并洗涤2次，然后将洗涤后的精子悬浮于0.25 mL 2%的醋酸溶液，4 ℃冰箱内进行24 h顶体酶的抽提，然后在>1 200 r·min-1离心10 min，其上清液用于顶体酶活性测定。测定时在试管内依次加入12 mg·mL-1NAD 0.1 mL、1 mg·mL-1BAEE 0.5 mL、1.8 mg·mL-1ADH 0.1 mL和pH 8.7、0.05 mol·L-1三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液2.25 mL，25 ℃下水浴5 min。记录加入0.05 mL上清液后，10 min反应液在366 nm处吸光度的变化值。

蚯蚓精子顶体酶活性单位为每毫克蛋白质的顶体酶活性，因1个毫单位(mU)的顶体酶活性等于在上述反应条件下(pH 8.5和25 ℃)，每分钟水解1 nmol·L-1的BAEE所需要的顶体酶量。因为水解1 nmol·L-1的BAEE使反应液的吸光度变化0.0011，所以每毫克蛋白质内的顶体酶活性按下列公式计算[38]：

式中：t是反应时间(10 min)，△A是在t时内吸光度的变化值，V是加入酶液的体积(0.05 mL)。所以，顶体酶活性公式为:

1.5 精子密度测定方法

取出蚯蚓，麻醉后解剖，取出贮精囊放入盛有适量生理盐水或PBS的离心管中，通过挤压方法释放贮精囊中的精子形成悬液，置于37 ℃水浴箱孵育，液化后使用Cell-VU计数池(Millennium Sciences Inc，美国)在光镜下进行精子计数。

1.6 数据统计与分析

利用Design-expert 8.0.6软件对实验数据进行处理和回归分析，利用SPSS 26.0软件对实验数据进行显著性分析，字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2 结果(Results)

2.1 蚯蚓顶体效应检测

蚯蚓精子经考马斯亮蓝染色结果如图1所示，蚯蚓精子尾部被染成紫蓝色，头部呈现出2种染色特征a和b，a型精子顶体区染成浅紫色，b型精子顶体区染成紫蓝色。a型为已经发生顶体反应。蚯蚓精子顶体率的测定结果如表2所示，实验结果表明，蚯蚓精子存在顶体反应，顶体率(47.67±3.87)%。

表2 蚯蚓顶体效应

图1 精子考马斯亮蓝染色图像

2.2 蚯蚓顶体酶测定条件的优化及方法建立

采用Design-expert 8.0.6软件对实验结果进行多元回归拟合，得出洗涤次数(A)、抽提时间(B)、ADH浓度(C)与NAD浓度(D)与蚯蚓精子顶体酶活性(Y)这个响应值之间不是简单的线性关系，得到二次回归方程(模型)为：Y=-1.12A2+0.45B2-1.36C2-2.19D2-0.31A+1.22B+0.76C+1.23D-0.66AB-0.42AC-0.59AD-0.014BC-0.18BD-0.51CD+16.84。

利用正交实验获得的数据，采用响应面回归方法对顶体酶活性测定条件与各影响因素的关系进行了拟合。结果表明，拟合方程的一次项、二次项与交互项对于响应值的影响都显著，按照各因素的F值大小，各因素对蚯蚓精子顶体酶活性测定条件影响的显著性从大到小依次为：NAD浓度>抽提时间>ADH浓度>洗涤次数[39]。

通过拟合模型响应面分析，优化后最佳试验条件为洗涤2次，抽提时间24 h，ADH浓度1.8 mg·mL-1、NAD浓度12 mg·mL-1，其测定过程中试剂消耗量减少，分析时间缩短，检测成本下降。优化条件下预测顶体酶活性为18.5038 mU·mg prot-1，试验值为18.4839 mU·mg prot-1，试验值与预测值吻合较好，表明此法适用于蚯蚓物种，响应面回归模型的有效性得到验证[40]。

2.3 测定时间的选择

建立的测定方法中，测定顶体酶活性依旧是一段时间内顶体酶活性变化值，因此蚯蚓精子顶体酶活性测定法需探究反应液随反应时间的延长时，时间与吸光度变化值的线性关系。顶体酶活性随时间变化的吸光度变化结果如图2所示，实验结果表明，顶体酶活性在15 min内对BAEE有极好的线性水解反应。因此测定10 min的酶反应速度能够保证结果的准确性和稳定性。

图2 蚯蚓精子顶体酶活性测定

2.4 方法学考察

蚯蚓储精囊中蛋白质含量测定参考郭垠利[41]的方法，测定595 nm处吸光值，并绘制标准曲线，其方程为y=4.5014x-0.005，R2=0.9995。

醋酸棉酚暴露3 d后对蚯蚓精子顶体酶活性的影响如表3所示，实验结果表明，蚯蚓精子密度从(8.61×107±0.75) 个·mL-1随着醋酸棉酚浓度的增加衰减为(1.91×107±2.5) 个·mL-1，其精子被杀死、抑制效果越来越明显。蚯蚓精子顶体酶活性从(18.15±0.89) mU·mg prot-1随着醋酸棉酚浓度的增加衰减至(3.16±0.37) mU·mg prot-1。而精子顶体酶活性与精子密度之间存在线性关系，线性方程为y=2.1686x-0.3504，相关性为0.9908。因此，随着精子密度的下降，其顶体酶活性也呈下降趋势，结果表明，蚯蚓精子顶体酶活性可作为生殖指标来检测环境污染变化。

表3 醋酸棉酚对蚯蚓的影响

3 讨论(Discussion)

精子获能是正常受精的前提，形态学表现为顶体反应。受精过程中具有完整顶体的精子才能成功受精，因此，精子顶体反应检测是精子质量评价的关键环节[16]。考马斯亮蓝法是目前检测精子顶体反应的常用方法，根据现有报道，考马斯亮蓝法可以用于不同动物品种的顶体检测，不仅适用于小鼠和人的精子，在其他种属间中有一定的通用性[42-43]。近年来，Moller等[21]和Aarons等[22-23]采用考马斯亮蓝染色法检测小鼠精子顶体反应，江一平等[24]将此法移用于人精子顶体反应的检测，并推广到多种哺乳动物精子顶体反应的检测。Larson和Miller[25]采用考马斯亮蓝染色法来检测包括人、牛、猪、兔和小鼠等精子的顶体反应，并采用经典的荧光亲和技术(PSA)证明其可靠性[43]。本研究结果表明，蚯蚓精子中也存在顶体反应，采用考马斯亮蓝法检测到蚯蚓精子顶体率为47.67%±3.87%。

为了考察建立的蚯蚓精子顶体酶测定方法的可靠性，采用目前公认的具有生殖毒性物质的醋酸棉酚来对蚯蚓进行土壤暴露实验，结果表明，蚯蚓在醋酸棉酚污染的土壤中暴露3 d后，就可以快速检测出它的顶体酶活性的变化，而且活性变化与精子密度质量的变化具有显著的相关性(r=0.9908)；动物实验结果表明[44-45]，棉酚药理作用机制是通过破坏雄性睾丸细精管的生精上皮细胞，从而导致精子数量的减少，直至无精子产生，停药后可恢复[46]，即顶体酶活性在判定精子的受精能力方面更具有客观性[47]；Cui等[48]研究发现，精子顶体酶与精子繁育性能密切相关；Howes和Jones[49]认为，顶体酶可以作为判断动物生育力的一项指标。

蚯蚓顶体酶活性与目前常用于评价土壤污染物的生殖毒性相关指标相比，蚯蚓顶体酶的响应时间均优于产卵量和孵化量等常用指标[13]。如孵化量指标需要56 d后才能检出，产卵量指标异常变化的检出时间为28 d，而蚯蚓顶体酶活性的异常变化3 d后即可检出。与产卵量和孵化量等常用的生态毒理学指标相比，蚯蚓顶体酶指标对污染监测具有时效性和灵敏性的特点，与实验农药的毒性机理及可能产生的生态后果具有一定的相关性[14]。实验结果表明，蚯蚓精子顶体酶可作为土壤污染的生态风险监测及早期预警的可行的监测指标，因此蚯蚓顶体效应及其在土壤健康质量诊断中的应用具有重要意义，有望作为生物标志物应用于土壤污染的生态毒理学快速诊断。