QuEChERS试剂盒-高效液相色谱法检测鸡蛋中阿散酸和洛克沙砷残留

赵 颖，李典典，张大卫，魏 月，马晶军

（河北农业大学理工学院，河北沧州 061100）

阿 散 酸（arsanilic acid，ASA）和 洛 克 沙 砷（roxarsone，ROX）等有机砷制剂被广泛应用于畜禽生产中，其添加目的为促进生物生长，并提高饲料的利用率[1-2]。由于动物长期食用添加ASA和ROX的饲料，导致生物体内器官及组织中会残留有机砷类物质，并通过食物链的作用对人体生理机能造成不同程度的破坏[3-5]。我国于2017年7月31日发布停止使用ASA和ROX作为饲料添加剂的公告，但目前对二者的研究主要集中在饲料、肉类食品中，例如SaucedoVelez等[6]利用微波辅助萃取技术联合高效液相色谱法对牲畜饲料中ASA、ROX及硝苯砷酸进行痕量测定；王莹等[7]采用高效液相色谱串联质谱技术分析鸡肉中ROX残留量及其代谢物残留规律，而对蛋类的研究则较少，因此有必要建立定量检测鸡蛋中的ASA和ROX的方法，为完善动物源性食品中有害物质的分析标准提供技术支持。

近些年，常用于食品中有机砷制剂的萃取方法有固相萃取法（solid phase extraction，SPE）[8-9]、超声波辅助萃取法[10-11]、加速溶剂萃取法[12-14]等，然而这些萃取方法或操作繁琐或耗时较长，不适用于检测大批量的样品。2003年，Anastassiades等[15]首次建立了 QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective,Rugged, Safe）前处理方法用于果蔬中农药残留的检测，该方法简便、高效、安全，耗时较短且减少了有机溶剂使用量，近几年被广泛应用于动物源性食品中兽药的残留分析[16]。

本试验拟采用QuEChERS的前处理方法，联合高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析鸡蛋中痕量的ASA和ROX，以期为动物源性食品中有机砷类兽药残留提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈、三氟乙酸 均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；ASA、ROX 纯度≥99%，上海楚定分析仪器有限公司；多壁碳纳米管 纯度≥97%，中国科学院成都有机化学有限公司；QuEChERS分散固相萃取净化试剂盒（型号：5982-5022，内含净化填料400 mg PSA、400 mg C18EC、45 mg GCB、1199 mg MgSO4） 美国Agilent公司；QuEChERS萃取试剂盒（型号：5982-5058，配有袋装萃取填料MgSO4、NaCl） 美国Agilent公司；DIKMA ProElut C18填料 北京迪科马科技有限公司；弗罗里硅土、氧化铝填料 北京迈瑞达科技有限公司；Waters Oasis MAX固相萃取柱（规格：3cc/60 mg） 上海楚定分析仪器有限公司。

1525型高效液相色谱仪，配有2998光电二极管阵列检测器 美国Waters公司；ZORBAX Eclipse Plus C18液相色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）、Agilent 6460型串联三重四极杆质谱，配Agilent1290型液相色谱仪 美国Agilent公司；HC-3018R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；HGC-12A型氮吹仪 恒奥科技发展有限公司；MXS型涡旋仪 美国SCILOGEX公司；Mill Q超纯水系统 美国Millipore公司；KQ5200E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；AUY120/220型电子天平 日本岛津科技有限公司；FG-12型固相萃取仪器 天津市富城达科技有限公司；SHZ-111循环水真空泵 上海知信实验仪器技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液制备 分别称取2.5 mg（精确到0.1 mg）ASA、ROX标准品至25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成100 mg/L的标准储备液，避光保存。将标准储备液用甲醇稀释成1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的系列标准工作溶液待用。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 SPE法 取0.5 g（精确到0.1 mg）鸡蛋样品置于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇与5%三氟乙酸水溶液（9:1，V/V），涡旋5 min，10000 r/min离心5 min，将上清液转移至10 mL离心管中，残渣中再加入提取液5 mL，重复上述步骤，合并上清液，经旋蒸至剩余5 mL，再分别用C18柱、MAX柱和填充多壁碳纳米管柱对ASA、ROX进行净化。试验中SPE装置净化步骤： 取5 mL甲醇活化0.5 g（精确到0.1 mg）固相萃取小柱；5 mL上清液进行上样；5 mL甲醇与水（1:1，V/V）淋洗杂质；采用优化的洗脱剂甲醇与甲酸（60:40 ，V/V）5 mL进行洗脱，收集洗脱液，流速控制为1 mL/min。30 ℃用氮吹吹至1 mL以下，用甲醇定容至1 mL，过0.45 μm有机滤膜，供HPLC检测。

1.2.2.2 基质固相分散萃取法（matrix solid phase dispersion extraction，MSPDE） 向玛瑙研钵中准确加入0.5 g（精确到0.1 mg）加标样品，分别用0.5 g（精确到0.1 mg）弗罗里硅土与0.5 g（精确到0.1 mg）中性氧化铝填料进行净化，充分研磨5 min，使样品与填料完全混匀，并将混合物转移至萃取柱中。用甲醇与甲酸（60:40，V/V）作洗脱剂，在重力作用下对目标物进行洗脱，随后用10 mL离心管收集洗脱液。收集3 mL后，30 ℃氮吹吹至1 mL以下，甲醇定容至1 mL，过0.45 μm有机滤膜，进行色谱分析。

1.2.2.3 QuEChERS试剂盒法 取0.5 g（精确到0.1 mg）鸡蛋匀浆于50 mLQuEChERS萃取管（配有袋装萃取填料MgSO4、NaCl）中，加入15 mL乙腈与10%三氟乙酸的甲醇溶液（1:1，V/V），涡旋5 min，再加入QuEChERS试剂盒的提取填料，10000 r/min离心5 min，移取上层液（约5 mL）于QuEChERS净化管（内含净化填料400 mg PSA、400 mg C18EC、45 mg GCB、1199 mg MgSO4）中，涡旋5 min，10000 r/min离心5 min，移取上清液于氮吹管中，氮气吹至1 mL以下，甲醇定容至1 mL，过0.45 μm有机滤膜，得待测样品。

1.2.3 HPLC检测条件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色谱柱（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），柱温20 ℃，进样量：10 μL。检测波长为260 nm。流动相为甲醇与0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V），等度洗脱。

1.2.4 UPLC-MS/MS检测条件 色谱条件：流动相为0.1%三氟乙酸水溶液（A）与 甲醇（B），等度洗脱泵A与泵B（70:30，V/V），流速为0.2 mL/min，进样量2 μL。质谱条件：电喷雾电离源（ESI），负离子扫描，锥孔电压40 V，毛细管电压3.5 kV，脱溶剂气温度350℃。采用多反应监测扫描模式（MRM），ASA定性离子为m/z 123.03，碰撞能量16 V，及m/z 107.16，碰撞能量为34 V；ROX定性离子为m/z 123.26，碰撞能量为25 V，及m/z 153.07，碰撞能量34 V。

1.2.5 方法学评价

1.2.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限 用ASA、ROX标准储备液配制浓度分别为1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的标准工作溶液，进样后制作标准曲线，方法在1.00～100.00 mg/L范围内线性良好。将加标浓度逐级稀释添加于样品中测定信噪比，以3倍噪音（RSN=3）确定检测限（LOD）、以10倍噪音（RSN=10）确定定量限（LOQ）。

1.2.5.2 回收率和精密度 以空白基质样品进行1.00、50.00、100.00 mg/L 3个水平的加标回收试验，重复测定6次，按建立的方法处理样品，测定并计算回收率和精密度。

1.2.6 实际鸡蛋样品测定 选择普通鸡蛋、柴鸡蛋做实际样品测定，分别采集了4份来源不同的鸡蛋样品进行测定。试验样品的来源分别是：普通鸡蛋1，河北省保定市农贸市场；普通鸡蛋2，河北省保定市大型超市；普通鸡蛋3，河北省保定市某养鸡场；普通鸡蛋4，河北省保定市某集市；柴鸡蛋1，河北省保定市某养鸡场；柴鸡蛋2，河北省保定市批发市场；柴鸡蛋3，河北省保定市大型超市；柴鸡蛋4，河北省保定市菜市场。

1.3 数据处理

利用Microsoft Excel 2019软件进行数据整理分析。采用Origin 2017制图软件作图。

2 结果与分析

2.1 优化比较前处理方法

本试验首次比较了SPE法、MSPDE法及QuEChERS法中不同净化填料对目标有机砷制剂的净化效果，结果如图1所示。黄佳佳等[17]研究了多壁碳纳米管（MWCNTs）作为SPE填料对农兽药的吸附能力，结果表明其对极性化合物净化效果较好。故本试验比较了C18、MAX[9]和MWCNTs填料对目标有机砷制剂的净化效果，结果表明，C18对两种极性化合物吸附效果差，其具有较强疏水性；MAX填料吸附效果较好，但不易将目标物洗脱下来，操作繁琐；MWCNTs填料净化能力明显优于其它填料，由于其比表面积大，吸附能力较强，对于极性有机化合物有较高富集能力[18]，但在目标化合物附近易存在一定程度的色谱峰干扰，且回收率低于QuEChERS法。

在MSPDE法中，分别优化比较弗罗里硅土（Florisil）与中性氧化铝填料[19]净化效果，二者均为强极性吸附剂，对有机砷制剂有一定吸附能力。结果表明，添加Florisil对ASA、ROX的色谱图响应值较高。但采用优化的Florisil净化样品时，洗脱液有较多杂质，柱净化难度较大，除杂能力较弱。

QuEChERS法应用QuEChERS试剂盒进行样品提取净化，操作简单，省略了SPE中淋洗、洗脱等步骤，减少了分析物在转移过程的损失，且前处理快速；同时该法相比于MSPDE法杂质干扰小，净化萃取柱中含有的PSA、GCB等组合填料有效去除了鸡蛋样品中蛋白、磷脂以及色素等干扰物质，显著降低了基质效应。故本试验选择QuEChERS法进行前处理操作。姜涛等[20]利用微波辅助萃取法分析测定鸡蛋中ASA、ROX含量，但该仪器成本较贵，且试验所需优化影响因素较多，操作较繁琐，本试验中QuEChERS法装置简单成本较低，无需复杂操作且准确度较高。

净化效果越好，基质对目标化合物的干扰越小。由图1可知，3种方法对于同一加标浓度1 mg/L鸡蛋样品的净化效果，用QuEChERS法获得的响应值更高，并且在同一实验条件下目标物回收率均达到80%以上。为了使目标物回收率达到最佳，需对QuEChERS法进一步优化。

图1 三种前处理条件下不同净化填料的比较Fig.1 Comparison of different purification fillers under three pretreatment conditions

2.2 QuEChERS法条件的优化

2.2.1 萃取剂组成及浓度的优化 常见有机砷提取剂包括纯水、甲醇等单一有机溶剂或有机溶剂和水按一定比例的混合溶液。本试验在Eom等[21]研究的基础上，在同一提取比例下对不同萃取剂组成的乙腈、甲醇、水混合提取液进行优化试验，乙腈与甲醇组合时提取液较澄清，但由于鸡蛋样品中蛋白质含量较高，而酸性条件下有利于蛋白质沉淀，因此选择含三氟乙酸的甲醇溶液沉淀蛋白，并优化含三氟乙酸体积分数分别为0.05%、1%、5%、10%、15%的甲醇溶液对蛋白质沉淀和目标物萃取效率的影响（图2）。结果表明，当采用乙腈与10%三氟乙酸的甲醇混合溶液时提取效率较好，ASA、ROX的回收率均达到91%以上。

图2 在相同试验条件下萃取剂浓度对回收率的影响Fig.2 Effect of extractant concentration on the recovery under the same experimental conditions

2.2.2 萃取剂比例的选择 肖亚兵等[12]研究表明提取剂比例影响有机砷制剂的提取效率，故为保证萃取完全，试验比较了不同比例的萃取剂，如图3所示，乙腈与10%三氟乙酸的甲醇溶液（1:1，V/V）时，可最大程度地从鸡蛋样品中提取出ASA、ROX，且基质干扰较小。试验还比较提取次数对萃取率的影响，发现提取次数过多时，萃取率反而下降，可能是由于有机砷类物质与基质相互作用，导致目标物有所损失，故试验选择了一次提取。在采用优化的萃取剂比例下，两种目标物的回收率均达到了93%以上。

图3 相同试验条件下萃取剂比例对回收率的影响Fig.3 Effect of extractant in different proportions on the recovery under the same experimental conditions

2.3 HPLC条件的优化

通过二极管阵列检测器对ASA、ROX混合标准溶液进行全波长扫描，试验表明在260 nm处ASA、ROX有较强吸收。并采用Waters Atlantis T3 5 μm色谱柱对目标物质ASA、ROX进行分离。当只采用甲醇与水时，ASA出峰时间延后，且峰的锐度不好。杨丽君等[22]研究表明在流动相中添加一定量的三氟乙酸，有效缩短出峰时间，改善峰型。因此本实验中优化比较了甲醇分别与体积分数为0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的三氟乙酸水溶液作为流动相时目标物的出峰情况，最终采用甲醇与0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V），在10 min内实现两种目标物的良好分离，ASA、ROX保留时间分别为3.298、6.174 min，柱效较高，峰型尖锐对称，基线平稳，无杂峰干扰（如图4）。

图4 加标鸡蛋样品的HPLC图Fig.4 HPLC diagram of standard egg sample

2.4 UPLC-MS/MS条件的优化

为了丰富检测ASA、ROX的仪器方法，试验中还利用了UPLC-MS/MS对样品进行测定。流动相中的三氟乙酸可以改善峰型，并且有助于提高质谱负离子扫描时的离子化效率，故同样使用甲醇与0.1%三氟乙酸水溶液（30:70，V/V）作为流动相，等度洗脱，提高柱温对分离无明显效果，故确定现有色谱条件。

为提高分析灵敏度，选用MRM进行检测，同时对ASA、ROX进行定性离子通道分析，使定性更为准确；两种有机砷物质呈弱酸性且易失质子，质谱条件选择负离子模式，并采用电喷雾离子源，明显降低离子干扰[23]。试验还对喷雾电压、碰撞能量及离子源温度等参数进行了优化，进而提高方法准确性。结果表明，在优化条件下，以3倍噪音（RSN=3）确定LOD、以10倍噪音（RSN=10）确定LOQ。ASA的LOD为0.122 μg/kg，LOQ为0.372 μg/kg；ROX的LOD为0.254 μg/kg，LOQ为0.760 μg/kg。该方法检测限低、灵敏度高，但检测成本昂贵，且检测周期较长，不利于向中小型企业或检测机构推广。为了降低成本及考虑到方法的实用性，本试验使用HPLC技术分析检测两种目标物。

2.5 方法学评价

2.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限 将ASA、ROX混合标准储备液用甲醇稀释成浓度为1.00、5.00、10.00、50.00、100.00 mg/L的系列标准液，每个浓度重复测定5次。以色谱峰面积（Y）为纵坐标，ASA、ROX浓度（X）为横坐标绘制标准曲线。在HPLC最佳检测条件下，ASA线性方程为y=3.59×104x+1.33×105，R=0.999831；ROX线 性 方 程 为y=2.23×104x+6.59×103，R=0.999562，在 线 性 范 围1.00～100.00 mg/L线性关系良好。根据1.2.2样品前处理方法，以3倍噪音（RSN=3）确定LOD、以10倍噪音（RSN=10）确定LOQ。ASA、ROX的LOD分别为0.044、0.063 mg/kg；LOQ分别为0.149、0.211 mg/kg。试验还比较了近几年不同分析方法的灵敏度，见表1。

表1 不同方法灵敏度的比较Table 1 Sensitivity comparison of different methods

2.5.2 回收率和精密度 以空白基质样品进行3个水平的加标回收试验，重复测定6次，按建立的方法处理样品，测定并计算回收率和精密度见表2。结果如下：ASA的回收率92.32%～95.95%，相对标准偏差1.54%～4.92%；ROX回收率89.84%～94.91%，相对标准偏差2.19%～5.87%。加标鸡蛋样品的HPLC图见图4。

表2 样品加标回收率及精密度Table 2 Recovery and precision of standardized samples

2.6 实际鸡蛋样品测定

检测了普通鸡蛋和柴鸡蛋中ASA和ROX的含量，分别采集了4份来源不同的样品进行分析。试验中实际鸡蛋样品采集自私人养鸡场、农贸市场、菜市场、超市、批发市场和集市上，采集地点养鸡场、市场可能存在缺乏监管的现象，生产的鸡蛋会残留有ASA、ROX等饲料添加剂的问题，但按照建立的方法制备样品，经HPLC分析，均未有ASA、ROX检出（表3）。结果表明市售的鸡蛋不会对消费者构成危害。

表3 实际样品测定(mg/kg)Table 3 Actual sample determination(mg/kg)

3 结论

采用QuEChERS试剂盒，联合高效液相色谱法检测鸡蛋样品中ASA、ROX的残留含量。该方法高效、快速、简便，具有良好的稳定性和精密度。方法检出限ASA、ROX分别为0.044、0.063 mg/kg；定量限分别为0.149、0.211 mg/kg；相对标准偏差1.54%～5.87%之间。本试验采用的液相色谱法适用性广，检测成本低，且不受样品挥发性和热稳定性的限制[24-25]，分析速度快，可应用于其它动物源性食品中ASA和ROX的检测。