日龄对小鼠结肠组织形态和杯状细胞数量的影响研究

刘晓东，彭利兰，龙征荣，李桂兰

（黔东南民族职业技术学院，贵州 凯里 556000）

结肠是大肠的一部分，是重要的消化和排泄器官，参与体内纤维和水分的消化和吸收。杯状细胞亦称杯细胞，仅见于哺乳动物进行黏液分泌的单细胞腺，主要以单个散在形式分布在消化道、呼吸道等管道的黏膜上皮及其相关导管上皮内［1］。最新研究表明，小鼠和大鼠结肠黏膜上皮的动力模型与小肠相似，其杯状细胞由位于结肠腺底部的干细胞在向表面迁移的过程中增殖，它能分泌黏液，促进营养物质的消化和吸收［2］。

多年来，人们对不同部位杯状细胞的形态功能及其与疾病的关系给予了足够的重视，由于它是重要的免疫相关细胞，所分泌的黏液对肠上皮起润滑保护作用，且有研究表明杯状细胞可能在肠黏膜损伤后的重建过程中起关键作用，因此一定数量的杯状细胞对维持黏膜屏障结构不可或缺［3］。近年研究还发现，杯状细胞可能涉及黏膜修复、黏膜免疫、肿瘤发生等多方面生理和病理过程。因此正确掌握常规状态下杯状细胞的结构和数量变化，对于了解其功能有很大帮助。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 莱卡石蜡切片机，光学显微镜（OLMPUS），光学显微照相仪（Nikon ECLIPSE 50i），数显恒温箱，电子天平；酒精，甲苯，石蜡，蛋白胶，二甲苯，中性树脂胶，10%福尔马林，苏木精，伊红。

1.2 实验动物及日粮 健康怀孕雌鼠12 只，购于四川农业大学动物生理实验室，日粮组成：玉米、豆饼、豆粕、鱼粉、磷酸氢钙、硫酸铜、各种维生素、微量元素、添加剂等，其配方含量和营养水平符合实验小鼠的饲养标准。

1.3 方法

1.3.1 动物饲养管理 将12 只健康怀孕雌鼠分笼饲养，温度控制在18～22 ℃，湿度控制在50%～60%，人为制造昼夜交替。自由饮水，每日喂料两次，定期更换饮水和垫料，幼鼠于20 日龄断乳后按雌雄分笼饲养。

1.3.2 结肠组织HE 染色 随机取6、9、13、17、22、28 日龄小白鼠，用电子天平分别称重，并用SPSS 20.0 统计软件处理数据，分析组间个体差异显著性。分别将个体差异不显著的4只小白鼠颈椎脱臼处死，解剖，完整取出各只小白鼠的结肠，按常规取肠组织l～2 节，用100 mL/L 中性福尔马林溶液固定。对每组4只小白鼠的结肠组织进行常规HE染色。

1.3.3 组织学观察 在100倍光镜下观察结肠的大体结构，400 倍光镜下观察结肠黏膜、黏膜下层、肌层、浆膜的形态和分布情况。将每组4只小白鼠的切片分别在400 倍视野中任取3 个视野，用爱谱图像处理分析软件4.0 进行杯状细胞计数，并测量结肠黏膜和肌层在发育过程中的厚度。每组的杯状细胞计数和黏膜、肌层厚度各测量3 次，用SPSS 20.0 统计软件处理数据，取平均值，并分析各组间的差异是否显著，分析杯状细胞的数量变化以及黏膜、肌层厚度的变化，最后把杯状细胞的数量变化通过柱状图分析出来。两组之间差异不显著用相同字母表示（P＞0.05），差异显著用不同字母表示（P＜0.05）。

2 结果

2.1 小鼠结肠胚后发育的形态变化 HE染色后光镜下观察可见结肠黏膜上皮细胞排列整齐，上皮层和固有层界限清楚，柱状细胞呈高柱状，胞核为椭圆形，靠近细胞基部，杯状细胞呈高脚杯状，上部膨大，下部细窄，呈典型的高脚状，无纵纹缘，仅有一层很薄的细胞膜散在于柱状细胞之间，上皮细胞轮廓清晰，染色鲜明，呈正常生长更新状态。

6 日龄时，结肠黏膜上皮由2～3 层细胞构成，肠腔不明显，呈裂隙状，略向肠腔隆起，无明显指状绒毛突起，形态学上未见典型的杯状细胞。9日龄时，形成明显的皱褶，黏膜表面覆盖单层柱状上皮，近根部为复层柱状上皮，见一些杯状样、囊状和梨形的空泡，肠绒毛很短。13 和17 日龄时明显看到很多杯状样的空泡细胞形成，22 和28 日龄可见黏膜上皮明显增厚，空泡样细胞密集。

2.2 黏膜和肌层的厚度变化以及杯状细胞的数目变化 从表1可知，随着日龄的增长，小白鼠结肠的排泄功能逐渐增强，黏膜和肌层的厚度在不断增加，6 日龄的黏膜厚度与9 日龄存在显著差异（P＜0.05），而肌层厚度在这两日龄不存在显著差异（P＜0.05）。黏膜厚度和肌层厚度在22日龄增加的幅度最大，与17 日龄存在显著差异（P＜0.05），在28日龄时，黏膜厚度是6日龄的近1倍，肌层厚度是6 日龄的2 倍多。同时，杯状细胞的数量不断增加，6日龄时杯状细胞的数目最少，与9日龄的数目存在显著差异（P＜0.05）。13日龄时结肠杯状细胞数目不断增多，比6日龄多出1倍。28日龄时杯状细胞的数目最多，与22日龄相比存在显著差异（P＜0.05），且28 日龄比22 日龄的数目多出1倍，比6日龄的数目多出5倍（P＜0.05）。

表1 结肠黏膜和肌层的厚度变化以及杯状细胞的个数变化

3 讨论与结论

小白鼠是目前药学、医学及生物学等科学研究中常选的实验动物材料之一，结肠是自然条件下实验动物最易感染和产生病变的器官之一，因此研究小白鼠结肠的胚后发育很有必要。

有文献指出，小白鼠于胚胎第11 d 出现盲肠，后肠末端原开口于泄殖腔，随着泄殖腔的分隔，于第14 d 背部演变为单独的结肠和直肠，而肠上皮的分化开始于胚胎第15 d，呈现一定规律的头尾梯度分化程序，首先是上皮通过细胞增殖，形成向肠腔的不规则突起，上皮内出现空泡等［4］。哺乳动物肠黏膜上皮是机体代谢最为活跃的场所，肠黏膜上皮细胞终身进行着不间断的自我更新，位于肠道隐窝部位的肠黏膜上皮干细胞保持着旺盛的增殖分化能力，凋亡脱落及受损坏死的细胞与干细胞增殖、分化之间保持着动态平衡。本实验观察显示，在小白鼠1～28日龄的生长发育过程中，其结肠的肠黏膜、杯状细胞、黏膜下层、肌层、浆膜结构随着日龄的增长不断分化完成，6 日龄杯状细胞的数量稀少，9 日龄有所增加，22日龄时增长缓慢，到28日龄时排列密集，数量明显增多。黏膜和肌层随日龄的增长不断增厚，十分明显。

通过统计学数据处理后得出小白鼠在6日龄时杯状细胞的数目最少，与9 日龄的数目存在显著差异，13 日龄时结肠不断分化，杯状细胞数目不断增多，比6 日龄多出1 倍。28 日龄时杯状细胞的数目最多，与22 日龄相比存在显著差异，且28日龄比22日龄的数目多出1倍，比6日龄的数目多出5倍。28日龄时杯状细胞的结构明显，数量密集，可见细胞内含有大量黏液，由于黏液有助于粪便排泄，说明小白鼠在这个时间段结肠已发育成熟，排泄功能完善。

综上所述，随着日龄的增长，结肠的杯状细胞在不断增多，肠黏膜和上皮厚度在不断增加，结肠的排泄功能和肠黏膜屏障功能也在不断增强。