基于网络药理学探究清热解毒与补气养血中药配伍对骨髓炎的分子作用机制

时永健,杜全红,隋明军,隋海明

(1.山东中医药大学，山东 济南 250035；2.山东省文登整骨医院，山东 威海 264400)

骨髓炎是一种由化脓性细菌感染骨髓、骨皮质及骨膜等引起的慢性感染性疾病，常会造成周围软组织溃烂坏死[1]。多数由糖尿病足及血源性骨感染引起，但近年来随着坠落伤、交通伤等高能量损伤发生率增加,骨髓炎已成为开放性骨折、内固定手术的常见并发症[2]。慢性骨髓炎往往反复发作,迁延难愈,急性发作常引起高热、局部疼痛，若诊治不及时也会转为慢性，并造成局部肌肉萎缩、关节僵硬等,必要时不得不做出截肢保命的选择，严重影响患者生活质量，给家庭及社会造成沉重的经济负担[3]。因此，寻找治疗骨髓炎的有效药物、途径迫在眉睫。随着中医药的不断发展，越来越多的研究着眼于骨感染治疗，并取得一定的临床疗效。有报道显示，常规抗菌药物联合中药能产生协同作用，有效抑制多重耐药菌[4]。

骨髓炎在中医属“附骨疽”范畴,其病机为湿热之毒结聚于骨，或病后余毒未清，湿热内盛，化为深部脓疡，热毒注骨,正虚邪侵为其主要病机[5-6]。多项数据挖掘研究发现，中药治疗骨髓炎中当归、黄芪、甘草、金银花使用频率最高[7-8]。当归补血活血，为补血之圣药；黄芪补气升阳、托毒生肌，为补中益气要药；甘草补气、缓急止痛、清热解毒；金银花清热解毒，为治热毒所致痈疮之要药。四药共奏清热解毒、补气活血之功,符合消、托、补治法，在清热解毒之时又补气养血，顾护正气。鉴于此，本研究利用网络药理学相关技术探究当归、黄芪、甘草、金银花配伍治疗骨髓炎过程中可能存在的分子作用机制，为探索中药组方治疗骨髓炎提供思路与方法。

1 资料与方法

1.1 研究资料 本研究涉及的数据来源及运算平台主要是中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、Pub Chem数据库、Swiss Target Prediction数据库、Drug Bank数据库、Uniprot数据库、疾病基因数据库、人类基因数据库人类孟德尔遗传综合数据库、综合型药物数据库、治疗靶标数据库以及基因功能注释数据库。

1.2 研究方法

1.2.1 中药活性成分及靶点筛选：依据TCMSP获取当归、黄芪、甘草、金银花符合参数标准(500≥MW≥180、AlogP<5、Caco-2>-0.4、OB≥30%、DL≥0.18)的活性成分，并通过PubChem数据库保存对应SMILES及2D结构。将所得结构导入Swiss target prediction及Drugbank数据库进行靶点预测，取0.85相似性阈值及人类基因型为筛查条件。经Uniprot数据库转换基因名称去重整合后，利用 Cytoscape 3.7.2软件构建散活性成分-靶点作用网络。

1.2.2 骨髓炎靶点筛选：以“Osteomyelitis”作为关键词，采用疾病基因数据库、人类基因数据库、人类孟德尔遗传综合数据库、综合型药物数据库以及治疗靶标数据库对UF已知靶基因进行检索与筛选，合并各数据库的疾病靶基因。

1.2.3 网络构建、映射分析：将所筛选的中药潜在靶基因与骨髓炎靶基因交叉生成Venny图，得出中药治疗骨髓炎的映射靶基因，借助String数据库构建关键靶点，相互作用PPI网络图，并根据节点连接度(degree)值的大小进行筛选，得到核心靶基因。

1.2.4 关键靶点富集分析、通路分析：将筛选出的核心靶基因导入基因功能注释数据库，进行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及GO(Gene ontology，GO)生物过程的富集分析。以P≤0.05为筛选标准，分别将筛选出的前20个GO条目与KEGG条目借助Omic Share云平台绘制富集分析气泡图。

2 结 果

2.1 药物与疾病的靶基因 经TCMSP数据库筛选出17个活性成分，具有161个靶基因(图1)。经相关疾病数据库搜索查重后共选出140个骨髓炎已知靶基因，映射出关键靶点127个。

图1 药物活性物质靶点图

2.2 药物与疾病的核心靶基因 经String数据库在0.4中信度下生成相互作用PPI网络(图2)，其中127个节点之间共有666条相互作用关系，平均自由度为11.6，以degree值≥23筛选到核心靶点13个(图3)。

图2 关键靶点相互作用PPI网络图

图3 核心靶点图

2.3 前20个生物过程及信号通路 经David数据库获得126项GO富集结果及42条KEGG信号通路，以P值升序排列，分别筛选出符合条件的20个生物过程和信号通路，并将其以气泡图的形式展现出来(图4、5)。通路下所含靶点，见表1。

表1 KEGG通路下所含靶基因

图4 GO富集分析气泡图

图5 KEGG通路分析气泡图

3 讨 论

通过TCMSP平台分析得出，槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、异鼠李素等可能是黄芪、当归、甘草、金银花治疗骨髓炎的有效成分。骨髓炎红、肿、热、痛等临床症状均是炎症的局部反应，而上述活性物质在炎症反应中均有独特生物特性。槲皮素最突出的生理作用是抗炎[9]；现代药理学研究发现槲皮素具有较强抑菌作用，并对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等有抑制作用，广谱抗菌及不易耐药成为槲皮素特质[10]。木犀草素的多种药理活性也被证实与抗炎有关[11]，木犀草素一方面控制体内炎症因子和炎症介质分泌，另一方面木犀草素还可抑制炎症位置活性氧的产生并活化相关抗氧化酶，改善氧化应激的进一步损伤。山奈酚通过调控促炎酶活性和炎症相关基因的表达下调相关转录因子、MMP等，达到治疗炎性疾病的目的[12]。β-谷甾醇作为常见的植物甾醇之一，同样具有良好抗炎、抗氧化、免疫调节的生理作用。有研究发现β-谷甾醇能够减少NO的合成,抑制巨噬细胞IL-6活性,下调IL-1、TNF等炎症因子分泌[13]。体外实验同样发现，β-谷甾醇除选择性抑制外，还可通过抑制IL-6和TNF发挥抗炎作用[14]。随着研究的不断深入，在各组织、器官、系统中的抗炎作用正在不断被发现。异鼠李素通过有效抑制LPS，刺激炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α的释放；并作用于微生物细胞膜，从而影响相关蛋白酶[15-16]。由此可见，黄芪、当归、甘草、金银花四味中药多种活性物质在抗炎方面发挥着巨大作用。

经靶点映射发现关键靶点占骨髓炎潜在靶点的91%，说明黄芪、当归、甘草、金银花与骨髓炎具有密切联系，其活性成分能够作用于骨髓炎绝大部分的治疗靶点，AKT1、EGFR、HSP90AA1、SRC、ESR1等具有较高自由度，可能是治疗骨髓炎的关键所在，黄芪、当归、甘草、金银花除清热解毒，降低炎症反应外，还有其他生理作用干预骨髓炎进程。成骨细胞的凋亡在骨髓炎中起关键作用[17]，而AKT1具有调节成骨细胞成熟分化的作用；此外AKT1还可以诱导软骨内骨血管生成和骨化[18]，因而具有修复软骨能力。EGFR除参与炎症反应外，同样可以通过级联反应进一步促进血管生成与构建，并且广泛表达于人的表皮细胞，具有表皮组织修复作用[19]。炎症是氧化应激损伤表现方式之一,HSP90AA1是一种在遗传中高度保守的伴侣蛋白分子,在保护细胞氧化应激损伤中具有重要作用[20]。SRC对于成骨细胞迁移具有重要作用，有研究显示T3能够通过SRC激活PI3K-Akt信号通路，发挥特异性成骨作用[21]。ESR1能够促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞，因而对骨髓炎具有骨生成作用[22]。当然ESR1的转录活性是在核受体辅助因子调控下进行的，而SRC可以提高转录活性，活化核受体调节骨代谢[23-24]。众多靶点通过复杂的协同作用，依据多条通路调控骨髓炎发展过程，由此可见黄芪、当归、甘草、金银花清热解毒、补气养血的功效，不仅能改善炎症反应，同时能促进骨形成、骨修复以及血管生成、改善血运等。

通过基因可视化分析发现众多靶点主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、一氧化氮合酶调节剂活性、蛋白质对细胞核定位的正调控、ATP结合等多方面生物过程。核心靶点KEGG富集分析进一步揭示了黄芪、当归、甘草、金银花通过多条通路干预骨髓炎。其中，雌激素通路对促进成骨尤为重要，雌激素通过改善氧化应激水平抑制成骨细胞凋亡，诱导成骨细胞的增殖与矿化[25]。此外，雌激素结合受体后还可以抑制破骨细胞活性和增殖，加速凋亡作用，进一步促进骨生成[26]。研究表明，雌激素缺乏可引起相关促炎因子表达，其机制可能与雌激素缺乏对促炎因子的mRNA表达抑制作用减弱有关[27]。前列腺癌与骨代谢有关，前列腺癌往往伴随雄激素、睾酮的分泌下降，而雄激素、睾酮与雌激素同样在骨骼的成长发育过程中起着重要调节作用。陈晓英等[28]研究发现睾酮水平可调节炎症因子水平；相关研究进一步证明降低睾酮水平可显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平[29]。黏着斑信号通路可调控细胞黏附、生长及分化等多种生物过程，在生理活动中起重要作用。FAK是集中在黏着斑附近的一种激酶，参与多条转导通路，大量数据证实FAK能够调节细胞迁移和血管生成。FAK参与调节相关成骨通路的下游分子，特异性加强相关因子的表达，促进成骨分化，治疗骨缺损[30]。RAP1信号通路与细胞分化、黏附有关，有研究发现RAP1和VE能相互影响,协同调控内皮细胞的反应和血管壁的功能，改善血运，增加血管通透性[31]。成骨液诱导MC3T3-E1成骨细胞时，随诱导时间延长,Raplb表达量相应上调,因此Raplb参与了成骨细胞早期分化。甲状腺激素通路可影响成骨及破骨细胞的增殖、分化，调控OP。过高的甲状腺激素水平会上调4-HNE表达，而4-HNE可以通过IRAK1和TRAF6介导的炎症反应机制激活炎性通路，增强炎症反应，提高氧化应激水平。核心靶点富集出了大量通路，可见黄芪、当归、甘草、金银花对于骨髓炎的复杂调控过程。

本文从数据挖掘角度，分析中药治疗骨髓炎的处方规律，运用网络药理学相关方法从分子、通路方面分析清热解毒、补气养血相伍在骨髓炎中的治疗机制，为今后研究提供了新的方向。