黄芩苷对结肠癌HT-29细胞移植瘤小鼠IL-6/STAT3信号转导通路的影响

董宏丹

(中国医科大学附属盛京医院，辽宁 沈阳 110022)

结肠癌包括腺癌、未分化癌、黏液腺癌三种病理类型，常见于直肠与乙状结肠交界处，与直肠癌统称为大肠癌，为常见的消化道恶性肿瘤之一[1]。40～50岁是结肠癌的高发年龄段，流行病学资料显示，全球范围内，每年约有120多万新增结肠癌患者，并有约60万人因该病死亡[2]，我国的发病率约为29.44/10万[3]，虽然较欧美国家低，但近年来随着人们生活水平提高、饮食结构改变以及人口老龄化等因素，发病率和病死率也呈逐年上升趋势，给人们的生命健康造成的威胁不容小觑。结肠癌起病隐匿，往往发现时病情已经进展至中晚期，加大了治疗的难度。本病以手术治疗为主，辅以化疗、放疗等综合疗法[4]，但由于肿瘤耐药性、药物不良反应、肿瘤复发转移等现象存在，导致患者治疗后5年生存率仅为50%左右[5]，疗效不甚理想。因此，医学界致力于寻求更为安全、有效的抗肿瘤方案。有研究发现，中医药在减轻放化疗相关不良反应、改善症状、延长患者生存期等方面效果较好[6]。黄芩苷是中药黄芩中的活性成分，Wang等[7]的体外研究表明，黄芩苷具有抑制结肠癌HCT-116细胞增殖，并诱导其凋亡的作用。本研究主要探讨黄芩苷对结肠癌HT-29细胞移植瘤小鼠白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)/转录活化因子-3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号转导通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究动物：96只SPF级健康雄性昆明种小鼠，6～7周龄，体重18～22 g、平均(21.13±1.84)g，动物许可证号[SCXK(京)2014-0006]，购自斯贝福(北京)实验动物科技有限公司。将所有小鼠于层流柜内进行适应性饲养，温度设定在(25±3)℃、湿度设定在(50±10)%，控制噪音<55 dB，氨浓度<10 ppm，每日光照时间为10 h，饲以充足的灭菌普通标准饲料及酸化水，小鼠自由活动，定时更换垫料、消毒。适应性饲养时间为1周。

1.1.2 主要材料与试剂：HT-29人结肠癌肿瘤细胞株(南京科佰生物科技有限公司)；氟尿嘧啶注射液(规格 0.25 g/支，国药准字H21021858)，使用时采用无菌生理盐水配制成浓度为2 mg/ml的氟尿嘧啶溶液，现用现配；DMEM培养液(厦门研科生物技术有限公司)；ELISA检测试剂盒(孟成科技有限公司)；末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素标记dUTP缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)一站式检测试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)；细胞裂解液(上海浩然生物技术有限公司)；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测试剂盒(北京博奥龙免疫技术有限公司)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶配制试剂盒(北京纽朴生物技术有限公司)；SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(上海经科化学科技有限公司)；磷酸缓冲液、吐温20TBS缓冲液、5%脱脂牛奶(上海雅吉生物科技有限公司)；小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(上海恒斐生物科技有限公司)；ECL化学发光试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。

1.1.3 主要仪器设备：MIKRO 220R型离心机(Hettich公司，德国)、SDSGA9000型全自动石蜡切片机(Diapath公司，意大利)、全自动酶联免疫分析系统(Tecan公司，瑞士)、DMi8型荧光显微镜及配套成像分析系统(Leica公司，德国)、Powerpac型电泳仪(Bio-rad公司，美国)、QUN-S2000型全自动凝胶成像系统(上海启洵仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 黄芩苷：CAS号21967-41-9、纯度≥97%、规格5 g/支、货号981722，购自重庆普立科生物技术有限公司，使用时经60 ℃无菌生理盐水溶解并稀释后冷却，分别配制成浓度为2.5、5、10 mg/ml的黄芩苷溶液，保存于4 ℃冰箱内备用。

1.2.2 细胞悬液制备：取出复苏好的处于对数生长期的HT-29人结肠癌肿瘤细胞，滴加0.25%胰蛋白酶进行消化，1200 r/min，离心10 min，取细胞沉淀进行洗涤，重悬细胞并调整细胞浓度，制备浓度为2.5×107个/ml的HT-29人结肠癌肿瘤细胞悬液。

1.2.3 建模、分组及给药[8]：将经过适应性饲养的小鼠随机分为对照组16只、造模组80只。于右前肢腋窝处，造模组皮下注射2.5×107个/ml的HT-29人结肠癌肿瘤细胞悬液0.2 ml，对照组皮下注射灭菌生理盐水0.2 ml；继续饲养5 d后观察，若小鼠右前肢腋窝处有明显肿瘤结节生长，即为结肠癌移植瘤模型建立成功；对于造模组意外死亡或最终未能成功建立模型的小鼠及时补齐。模型建立第2天，将造模组小鼠随机分为模型组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及阳性对照组，各16只。模型组和对照组分别给予无菌生理盐水10 ml/kg，1 次/d，腹腔注射；黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组分别给予2.5、5、10 mg/ml的黄芩苷溶液10 ml/kg，1次/d，腹腔注射；阳性对照组予以2 mg/ml的氟尿嘧啶溶液10 ml/kg,1次/d，腹腔注射。各组小鼠均连续给药14 d。

1.2.4 标本采集与处理：末次给药后第2天称重，之后自眼眶采血2 ml，室温静置30 min，采用离心机3000 r/min、离心10 min，分离血清，-20 ℃冰箱保存备检；断头处死小鼠，将肿瘤组织完整摘取，用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、垂直横径(b)，电子天平测定肿瘤质量，对照组则切取右前肢腋窝处等量皮下正常组织；取1/2小鼠肿瘤组织(对照组取正常组织)采用4%多聚甲醛固定，之后常规采用梯度浓度酒精脱水以及石蜡包埋，并用石蜡切片机制成组织切片，厚度为4 μm左右；另外1/2肿瘤组织(对照组正常组织)采用液氮速冻，之后于-70 ℃冰箱保存，用于Western blot检测。

1.2.5 肿瘤体积、质量及抑瘤率检测[9]：检测各组小鼠肿瘤体积、质量及抑瘤率。肿瘤体积=0.52×a×b2；抑瘤率=(模型组平均肿瘤质量-用药组平均肿瘤质量)/模型组平均肿瘤质量×100%。

1.2.6 TUNEL法测定小鼠肿瘤组织细胞凋亡指数[10]:将1.2.4中制备的肿瘤组织石蜡切片取出，分别浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液10 min以脱蜡，然后分别浸入100%乙醇5 min、90%乙醇2 min、70%乙醇2 min、蒸馏水2 min，至切片水化。室温下，将切片浸入20 μg/ml蛋白酶K工作液中30 min以消化蛋白，PBS冲洗5 min×3次，之后按照试剂盒说明配制TUNEL检测液(含TdT酶和荧光标记液)，在37 ℃暗室内，于切片上滴加TUNEL检测液50 μl、孵育60 min、 PBS冲洗5 min×3次，抗荧光淬灭封片液封片，最后采用显微镜观察。在荧光显微镜下对切片进行观察，凋亡细胞的细胞核被染成棕黄色，每张切片随机选择5个不重复视野进行拍照，之后采用成像分析系统检测每个视野内细胞总数目以及凋亡细胞数目，根据细胞凋亡指数(Apoptosis index，AI)=凋亡细胞数目/细胞总数目×100%，计算肿瘤组织AI，并取平均值。

1.2.7 ELISA法测定小鼠血清IL-6、IL-10水平：将步骤1.2.4中制备的血清取出，37 ℃恒温水浴融化至室温，采用全自动酶联免疫分析系统，严格参照ELISA检测试剂盒的说明书进行操作，测定血清IL-6、IL-10水平。

1.2.8 Western blot法测定小鼠肿瘤组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平[10]：将1.2.3中冻存的肿瘤组织及对照组正常组织取出，用液氮研磨粉碎，加入含甲基磺酰氟的细胞裂解液1 ml充分匀浆，于冰上裂解20 min，4 ℃条件下，15000 r/min、离心15 min，取上清液，按照试剂盒说明采用BCA法测定总蛋白浓度；配制SDS-PAGE凝胶(12%分离胶、5%浓缩胶)并灌注于电泳仪内，然后将样品蛋白与5×加样缓冲液按4∶1体积混匀，上样；开始电泳，至溴酚兰跑至凝胶底部；之后将凝胶转移至NC膜上，置于5%脱脂牛奶内封闭2 h；4 ℃条件下，将NC膜分别置于IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2及内参β-actin一抗工作液内(1∶1000稀释)，孵育16 h、TBST漂洗10 min×3次；室温条件下，将NC膜置于HRP标记的羊抗鼠二抗工作液(1∶1000稀释)内，孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次；采用ECL化学发光试剂盒于暗室内进行曝光、显影、定影，晾干胶片。采用全自动凝胶成像系统对胶片进行扫描、拍照，用Image J图像处理软件测定各目的蛋白条带的灰度值(A)，计算IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白A值与内参β-actin A值的比值，分析各目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肿瘤体积、质量和抑瘤率比较 与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及阳性对照组小鼠肿瘤体积、质量均低，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。黄芩苷高剂量组和阳性对照组抑瘤率高于黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肿瘤体积、质量和抑瘤率比较

2.2 各组小鼠肿瘤组织AI比较 模型组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及阳性对照组小鼠肿瘤组织AI分别为(1.27±0.13)%、(24.56±2.68)%、(59.83±3.27)%、(78.34±3.65)%和(79.09±3.58)%，且黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组的肿瘤组织AI与模型组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。各组TUNEL法检测结果见图1。

A:模型组；B:黄芩苷低剂量组；C:黄芩苷中剂量组；D:黄芩苷高剂量组；E：阳性对照组

2.3 各组小鼠血清IL-6、IL-10水平比较 与对照组比较，其余各组小鼠血清IL-6、IL-10水平均升高，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及阳性对照组小鼠血清IL-6、IL-10水平较低，且各黄芩苷组呈一定量效关系，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清IL-6、IL-10水平比较(pg/ml)

2.4 各组小鼠肿瘤组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组小鼠肿瘤组织IL-6、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及阳性对照组小鼠肿瘤组织IL-6、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平较低，且各黄芩苷组呈一定量效关系，差异有统计学意义(均P<0.05)。各组间肿瘤组织STAT3 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3(图2)。

表3 各组小鼠肿瘤组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平比较

A:对照组；B:模型组；C:黄芩苷低剂量组；D:黄芩苷中剂量组；E：黄芩苷高剂量组；F：阳性对照组

3 讨 论

CRC发病率居于恶性肿瘤的第三位，且发病率逐年上升，已经成为社会公共健康中的一大难题。手术、化疗等治疗方案受到患者病情、耐受性、肿瘤细胞耐药等因素的影响，在治疗效果上受到限制，而中医中药具有多途径、多靶点发挥治疗作用的特点，在恶性肿瘤的治疗中往往能发挥减毒增效、改善生存质量等作用，故日益受到医学界关注。中医认为，结肠癌属“肠覃”“肠癖”“锁肛痔”“积聚”等范畴，病位在大肠，主要病机为正气不足、湿热蕴结、瘀毒内阻，治疗上也以清热化湿、化瘀解毒为主[11]。黄芩味苦、性寒，有清热燥湿、解毒之效，是结肠癌治疗中常用的中药，黄芩苷具有抗肿瘤、抗菌、肝脏保护、抗炎症反应、抗人类免疫缺陷病毒-1活性、糖尿病肾病保护、抗哮喘、保护脑缺血再灌注损伤等多种药理作用[12-13]，在肝炎、肾炎、过敏性疾病等的治疗中均取得了较好的疗效。许聪等[14]发现，黄芩苷可以通过逆转肿瘤细胞耐药性、细胞毒作用、诱导肿瘤细胞分化、抑制新生血管形成等途径控制肿瘤发展，对肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌等肿瘤细胞均有效果，抗癌作用广泛。

此次研究中，笔者分别采用不同剂量的黄芩苷对结肠癌HT-29细胞移植瘤小鼠进行治疗，结果发现，黄芩苷能使小鼠肿瘤体积和质量均低于模型组，并且黄芩苷剂量越高抑瘤率越高，提示黄芩苷能够发挥较好的抑制结肠癌HT-29细胞移植瘤生长作用，而且药物浓度越高抗肿瘤效果越明显。TUNEL染色结果发现，黄芩苷能提高小鼠肿瘤组织的AI，且黄芩苷高剂量组和阳性对照组肿瘤组织AI最高，表明黄芩苷对肿瘤组织细胞凋亡有促进作用。

凋亡异常、细胞失控性增殖是恶性肿瘤发生、发展的病理基础，诱导细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的重要途径[15]，也是许多抗肿瘤药物作用的最终靶点。肿瘤细胞内凋亡异常的信号通路有很多，此次主要研究黄芩苷对IL-6/STAT3信号转导通路的影响。IL-6为多功能的前炎症细胞因子，可以由包括肿瘤细胞在内的多种细胞合成释放，不仅能够参与炎症反应，还有抗肿瘤凋亡作用[16]。IL-6能够与其可溶性受体IL-6R结合，使细胞表面IL-6受体的β亚基和信号转导子gp130活化，并进一步激活STAT3。STAT3为重要的信号转导及转录活化因子，参与调控细胞增殖、凋亡、新生血管形成等，其异常持续激活能够引起细胞增殖、凋亡失衡，导致肿瘤发生[17-18]。Bcl-2是STAT3常见的下游基因，具有抗细胞凋亡作用，STAT3过度激活能够使Bcl-2处于异常高表达状态，致使肿瘤发生。研究发现，通过抑制STAT3磷酸化、调节IL-6/ STAT3信号通路活性，能够有效抑制结肠癌细胞HT-29增殖并诱导其凋亡[19-23]。本研究结果显示，高剂量黄芩苷能够有效降低血清及肿瘤组织IL-6类细胞因子表达，抑制STAT3激活，进而下调Bcl-2表达，这可能是黄芩苷促进肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤的作用机制之一。魏国丽等[24]的体外研究也发现汉黄芩素能下调STAT3信号通路、影响Bcl-2家族成员表达，抑制结肠癌HT-29细胞增殖，发挥抗结肠癌作用，这与本研究结果有相似之处。

综上所述，黄芩苷能剂量依赖性的抑制结肠癌HT-29细胞移植瘤小鼠肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡，其作用可能与抑制IL-6/STAT3信号转导通路活性有关。