肉鸡禽流感和新城疫免疫程序效果分析

陶天宇 程雪飞

（1，安徽省宣城市郎溪县农业农村局动物疫控中心 241000；2，中国农业科学院上海兽医研究所 200000）

高致病性禽流感（HPAI）致病原是正黏病毒科A 型流感病毒，该病毒主要传播途径为呼吸道，通常由禽类的分泌物、排泄物，受病毒污染的水等作为媒介传播。发病高峰期为春冬交替季节。现已衍生出16 种H 亚型和9 种N 亚型，其中毒力最强、致死率较高的亚型有H5N1、H7N9。禽类感染后主要病理变化为外部冠及肉髯发绀水肿，头部及脸睑水肿，病禽病例解剖后内脏浆膜、呼吸道和消化道黏膜、心脏发生大面积点状或斑状出血，肾、肝、肺表面和切面可见大小不均的灰黄色坏死灶等。急性禽流感感染的一般成爆发性流行态势，可出现短时间内鸡群大量死亡，解剖时无明显病变，致死率可达90%以上[1]。

鸡新城疫（ND）是由副黏病科毒I 型病毒引起的禽类动物疫病，主要传播途径为呼吸道和消化道。该病全年易发，尤春秋高发期。目前该病毒未发现其他血清型。禽类感染后主要病理变化为呼吸困难[2]，张口伸颈发出咯咯喘鸣，冠和髯呈暗红色和暗紫色，全身浆膜及呼吸道出血，淋巴结肿胀出血或坏死，腺胃黏膜和黏膜乳头水肿出血，盲肠扁桃体及回肠黏膜出血或坏死等。急性新城疫死亡率可达90%～100%。

高致病禽流感（HPAI）和鸡新城疫（ND）均为烈性动物传染病，具有高传染性、高致病性和高致死率，是严重危害畜禽养殖业的一类动物疫病。我国防控高致病禽流感和新城疫的举措主要为肌肉注射接种疫苗，因此，疫苗的免疫程序是影响免疫效果的重要因素之一。为监测疫苗免疫效果，采集郎溪县3 个大型817 肉鸡场共计420 个样本，采用凝血抑制（HI）法评估免疫效果，为本县内各养殖场针对新城疫和高致病禽流感的防控工作提供方案与数据参考[3]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通离心机，微型振荡仪，0.1～1ml 移液器若干，2～10ml移液器若干，移液器枪头若干，96 孔V 型血凝反应板5 块，50ml 烧杯若干，500ml 烧杯2 个，5ml 医用注射器若干，10ml医用注射器若干，生理盐水750ml，3.8%柠檬酸钠溶液30ml，新城疫和禽流感标准抗原和标准血清2 份[4]。

1.2 血清样本采集

本次试验所用的817 肉鸡血清均来自郎溪县境内的3 家大型肉鸡场。新城疫与禽流感免疫程序：9 日龄肌肉注射新城疫—禽流感H5N1二联灭活疫苗，0.2ml/只；17 日龄肌肉注射禽流感H7N9灭活疫苗，0.5ml/只；40 日龄新城疫—禽流感H5N1二联灭活疫苗，0.5ml/只；58 日龄肌肉注射禽流感H7N9灭活疫苗，0.5ml/只[5]。

采血时间为75 日龄肉鸡，样本数量为每个养鸡场120 份，共计420 份。翅下静脉采血，每只鸡采血2ml，标记密封后静置30min，低速离心机4500rpm 分离血清，-18℃冰箱冷藏。

1.3 试剂准备

新城疫、禽流感标准抗原和标准血清均采购于洛阳莱普森生物信息科技有限公司。

阿氏（ALsever）液配制：称量葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.8g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.42g，混合后加蒸馏水至100ml，散热溶解后将pH 调至6.1，69kPa 15min 高压灭菌，4℃保存备用。

1%红细胞悬液配制（100ml）：准备2 只SPF 鸡采血2～4ml与阿氏液1ml 混合后，放入装10ml 阿氏液的离心管中混匀，经1500～1800rpm 离心8min，吸出上清液舍弃，沉淀物加阿氏液混合后，再经1500～1800rpm 离心8min，吸出上清液及沉淀的红细胞上层白细胞膜舍弃，重复2 次以上过程后，加入阿氏液20ml，轻轻混合制成红细胞悬液。取制备好的红细胞悬液1ml，加入99ml PBS 溶液轻轻混合或用吸管反复吸打即可[6]。

1.4 检测方法

本次新城疫和禽流感抗体检测均采用血凝抑制实验（HI）方法。新城疫检测采用GB/T 16550-2008 《新城疫诊断技术》标准操作，禽流感检测采用GB/T 18936-2003 《高致病性禽流感诊断技术》 标准操作。

1.5 结果判定

以完全抑制4 个HAU 抗原的血清最高稀释倍数为HI 的抗体滴度。新城疫HI 抗体滴度≥5Log2 判定为合格，禽流感HI抗体滴度≥5Log2 判定为合格。

2 结果与分析

2.1 新城疫抗体效价分析

由表1 可知，A 场肉鸡新城疫抗体合格率为95.8%，平均抗体滴度为8.4；B 场新城疫抗体合格率为91.6%，平均抗体滴度为8.3；C 场新城疫抗体合格率为91.6%，平均抗体滴度为8.6。A、B、C 三场75 日龄肉鸡HI 抗体效价均大于70%，平均抗体滴度均大于8.0，95%滴度7.8～8.9。说明该新城疫免疫程序正确有效，抗体效价和平均抗体滴度均较高，具备良好的免疫保护能力。

表1 75 日龄肉鸡新城疫抗体效价结果

2.2 禽流感H5N1-Re5 抗体效价分析

由表2 可知，A 场肉鸡禽流感H5N1-Re5 抗体合格率为97.5%，平均抗体滴度为8.7；B 场抗体合格率为92.5%，平均抗体滴度为8.2；C 场抗体合格率为90.8%，平均抗体滴度为8.8。A、B、C 三场75 日龄肉鸡HI 抗体效价均大于80%，平均抗体滴度均大于8.0，95%滴度8.1～9.2。说明该禽流感H5N1-Re5 免疫程序正确有效，抗体效价和平均抗体滴度均较高，具备良好的免疫保护能力。

表2 75 日龄肉鸡禽流感H5N1-Re5 抗体效价结果

2.3 禽流感H7N9 抗体效价分析

由表3 可知，A 场肉鸡禽流感H7N9抗体合格率为94.2%，平均抗体滴度为8.7；B 场抗体合格率为96.7%，平均抗体滴度为8.1；C 场抗体合格率为90.0%，平均抗体滴度为8.0。A、B、C 三场75 日龄肉鸡HI 抗体效价均大于90%，平均抗体滴度均大于8.0，95%滴度8.1～9.2。说明该禽流感H7N9免疫程序正确有效，抗体效价和平均抗体滴度均较高，具备良好的免疫保护能力。

表3 75 日龄肉鸡禽流感H7N9 抗体效价结果

3 讨论

（1）本试验采取的免疫程序适用于养殖量较大，鸡舍较为密集的大型肉鸡养殖场，理论上新城疫和禽流感抗体阳性率不小于70%即可说明免疫程序合理，对鸡场可形成有效的保护力。但免疫效果易受鸡群免疫应答能力、疫苗品牌、接种方式、鸡舍卫生状况及当地流行病态势等因素影响。为保障鸡群生物安全，大型的养殖企业（场）有必要定期对阶段性免疫进行抗体监测抽查，及时控制疫病发生，防患于未然[7]。

（2）本试验新城疫和高致病性禽流感灭活疫苗交替免疫。全程新城疫、禽流感H5N1免疫间隔为31d，禽流感H7N9免疫间隔为41d。高致病型H5N1、H7N9是我国禽流感流行的主型，并且仍有发展出新基因型的趋势。将该型灭活疫苗一免和二免间隔适当加长3～7d 有助于鸡群体液免疫引起良好的二次免疫应答，从而形成有效的保护力。