不良孕产患者宫颈分泌物解脲脲原体和沙眼衣原体核酸检测及临床意义*

杨佳佳，李 涛，周明莉，赵 勇，梁树梅，张彦懿，黄江渝△

四川省成都市第三人民医院：1.临床医学检验部；2.妇产科；3.体检部，四川成都 610031

解脲脲原体(UU)和沙眼衣原体(CT)是引起人类泌尿生殖道感染常见的两种病原体，属于性传播疾病病原体，感染后可导致女性生殖道炎及盆腔炎，与自然流产、宫外孕、早产、不孕症等不良孕产结局密切相关，严重威胁育龄期女性生殖健康[1-3]。近年来，女性生殖道UU、CT感染率逐年增高，研究感染与自然流产、宫外孕、早产等不良孕产及不育不孕的相关性也越来越受到重视。随着分子技术的不断发展和提高，目前已有多种方法检测上述病原体，荧光探针聚合酶链反应(FQ-PCR)广泛应用于UU-DNA、CT-DNA的临床检测[4-5]，目前有些实验室开始采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测UU-RNA、CT-RNA[6]。本研究收集本院妇产科2018年6月至2020年5月收治的不良孕产患者的资料和宫颈分泌物，使用FQ-PCR和SAT分别检测宫颈分泌物的UU-DNA、CT-DNA与UU-RNA、CT-RNA，并对UU、CT感染与不良孕产的相关性进行分析探讨，以指导临床诊断和治疗。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2020年5月本院98例不良孕产和不孕症女性患者作为观察组，年龄19～47岁，平均(29.86±5.02)岁；其中自发性流产62例，异位妊娠16例，不孕症20例。另选取已婚体检健康女性38例作为对照组，年龄23～40岁，平均(30.58±4.04)岁。2组研究对象年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均知情并签署知情同意书。

1.2标本采集 所有标本均为女性宫颈分泌物。采用无菌窥阴器，充分显露宫颈，无菌棉拭子伸入宫颈口1～2 cm，旋转1周，停留5～10 s后取出，将棉拭子置于无菌试管，密闭送检。

1.3仪器与试剂 DA7600实时荧光定量PCR仪(中山大学达安基因股份有限公司)及FQ-PCR用于UU-DNA和CT-DNA检测。LC COBAS Z480实时荧光定量PCR仪(罗氏诊断产品上海有限公司)、MK-20干式恒温仪(杭州奥盛仪器有限公司)及SAT用于UU-RNA和CT-RNA检测。PCR-荧光探针法UU和CT核酸检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，RNA恒温扩增法UU和CT核酸检测试剂盒购自上海仁度生物科技有限公司，试剂盒均在有效期内，均严格按试剂盒说明书进行操作。

1.4方法

1.4.1FQ-PCR检测UU-DNA和CT-DNA 用1 mL无菌生理盐水将棉拭子充分洗脱后挤干棉拭子，将全部液体转至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min；去上清液，沉淀，加入1 mL无菌生理盐水充分混匀，12 000 r/min离心5 min；去上清液，沉淀，加入50 μL DNA提取液充分振荡混匀，100 ℃恒温处理(10±1)min，12 000 r/min离心5 min后备用。同时设置阴性、临界阳性、强阳性对照和外部质控品。将2 μL上清液加入PCR反应液中，93 ℃ 2 min，按93 ℃ 45 s到55 ℃ 60 s做10个循环，然后93 ℃ 30 s到55 ℃ 45 s做30个循环。结果判读严格按照试剂说明书进行。

1.4.2SAT检测UU-RNA和CT-RNA 利用磁珠分离方法制备RNA模板，按照试剂盒说明书，设置阴性和阳性对照。取400 μL加有保存液的分泌物标本和100 μL核酸提取液混匀，60 ℃恒温5 min，室温放置10 min，置于磁珠分离器上静置5 min，弃去液体，加入洗涤液洗涤2次，加入40 μL核酸反应液，充分混匀。取30 μL转移到反应管中，60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，加入42 ℃预热的SAT酶液，42 ℃实时恒温扩增 40 min。质量控制：按试剂说明书定期用临界弱阳性对照进行室内质量控制，dt阳性对照≤dt临界弱阳性对照≤35；dt阴性对照无数值或为40；否则，实验视为无效需重新进行。结果判读严格按照试剂说明书进行。

1.5统计学处理 采用SPSS16.0软件对数据进行分析处理。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验或F确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.12组研究对象宫颈分泌物中UU-DNA和CT-DNA检出情况 观察组UU-DNA、CT-DNA检出率和总检出率高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。在观察组和对照组中，UU-DNA检出率均明显高于CT-DNA，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组研究对象宫颈分泌物中UU-DNA和CT-DNA检出情况比较[n(%)]

2.22组不同年龄段宫颈分泌物中UU-DNA和CT-DNA检出情况 在<35岁年龄段，观察组UU-DNA、CT-DNA检出率和总检出率均高于对照组，观察组CT-DNA检出率也高于同组≥35岁年龄段，差异均有统计学意义(P<0.05)；在≥35岁年龄段，观察组UU-DNA检出率和总检出率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组不同年龄段宫颈分泌物中UU-DNA和CT-DNA检出情况比较[n(%)]

2.3不同临床症状患者UU-DNA、CT-DNA检测结果 自发性流产、异位妊娠和不孕症患者UU-DNA、CT-DNA检出率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同临床症状患者UU-DNA、CT-DNA检测结果[n(%)]

2.42组FQ-PCR和SAT检测结果比较 观察组UU-DNA与UU-RNA、CT-DNA与CT-RNA检出率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；对照组UU-RNA检出率明显高于UU-DNA，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组FQ-PCR和SAT检测结果比较[n(%)]

3 讨 论

育龄期女性性生活活跃，生殖道易感UU、CT等病原微生物，病原体可沿着生殖道上行蔓延，导致子宫内膜炎及输卵管损伤，引起盆腔广泛粘连，对女性生殖道健康造成严重影响，并可导致不孕和流产等不良后果[7-9]。女性感染UU、CT后常常无症状或症状轻微，从而忽略就医诊治，导致病情不良进展。目前，临床上通过各种实验检查，可明确UU、CT等病原体感染，指导临床诊断及治疗。

本研究采用FQ-PCR对UU-DNA和CT-DNA进行检测，观察组UU-DNA、CT-DNA检出率和总检出率均高于对照组，而且2组中UU-DNA检出率均明显高于CT-DNA，差异均有统计学意义(P<0.05)，这与近年报道一致[10-12]。临床上常常将35岁及其以上孕产妇称为高龄产妇，故在本研究中，以35岁为年龄划分界限，结果显示，不论在哪个年龄段，观察组UU-DNA检出率和总检出率均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。而观察组CT-DNA检出率在<35岁年龄段不仅高于同龄段对照组(P<0.05)，还高于同组≥35岁年龄段的不良孕产患者。这可能是因为<35岁女性正值育龄较佳的阶段，性行为活跃，增加了CT感染的概率[13]。

不同临床症状的患者，如自发性流产、异位妊娠和不孕症患者中UU-DNA与CT-DNA检出率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，说明不良孕产和不孕症患者的感染概率相差不大，但是由于症状不明显，这种感染在不孕症患者中往往是潜伏性的，不易发现。有文献报道，经治疗后UU和CT转阴的患者，妊娠率明显高于未转阴者[14]，故对无症状或症状不明显的育龄期妇女进行UU和CT检测，具有重要意义。

本研究使用FQ-PCR和SAT分别检测病原微生物的DNA和RNA。SAT是将实时荧光检测技术和核酸恒温扩增技术相结合的一种新型RNA检测技术，具有很高的灵敏度和特异性[15]。本研究发现，UU核酸阳性检出率较高，观察组中UU-DNA与UU-RNA检出率相当，差异无统计学意义(P>0.05)，与石瑛等[16]报道一致。观察组中CT-DNA与CT-RNA检出率差异无统计学意义(P>0.05)。但在对照组中，UU-RNA检出率明显高于UU-DNA(P<0.05)。说明在自发性流产、异位妊娠和不孕症患者中，FQ-PCR和SAT两种技术对UU和CT的检出率相当，但在无症状的体检健康人群中，由于SAT的灵敏度高[17-18]，UU-RNA的检出率更高。因此，SAT在无症状感染人群中监测生殖道UU感染的优势较明显。

综上所述，不良孕产患者宫颈分泌物UU检出率较高。FQ-PCR和SAT检测均能为临床诊断UU和CT感染提供依据。在无症状感染人群中，SAT检测UU更具优势，有利于临床对UU感染者早发现、早诊断和早治疗，对保障妇女生殖道健康、降低不孕不育发生率具有重要意义。