lncRNA NNT-AS1和miR-424在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义

马宇光,昝 瑛,王 梦,高 潇,赵 芳,张淑群

西安交通大学第二附属医院肿瘤科,陕西西安 710004

子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，2017年有6.2万例左右新诊断病例[1-2]。有研究报道，长链非编码RNA烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(lncRNA NNT-AS1)在多种恶性肿瘤中表达上调[3-5]，且lncRNA NNT-AS1可以与微小RNA-424(miR-424)结合促进胃癌的发生和周期进展[6]。miR-424是肿瘤相关miRNA[7]，在不同恶性肿瘤中可发挥促癌或抑癌作用[8-10]，而在子宫内膜癌中miR-424低表达可抑制肿瘤细胞侵袭和克隆球形成[11]。本研究旨在探讨lncRNA NNT-AS1和miR-424在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年2月至2014年10月在本院行手术切除的60例子宫内膜癌患者的子宫内膜癌新鲜组织为研究材料。纳入标准：(1)患者首次行手术切除；(2)切除组织经病理专家证实为子宫内膜癌；(3)患者未经任何形式的肿瘤治疗；(4)具有完整的临床病理和随访资料。排除标准：(1)子宫内膜癌远处转移者；(2)合并其他器官肿瘤者；(3)合并心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍者。子宫内膜癌患者年龄38～76岁，平均(56.81±10.44)岁；组织病理类型为子宫内膜样42例，非子宫内膜样18例；国际妇产科联盟(FIGO)分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期16例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例；肌层浸润程度，<1/2肌层39例，≥1/2肌层21例；病理分级，G1 31例，G2 20例，G3 9例；脉管浸润28例，无脉管浸润32例；淋巴结转移43例，无淋巴结转移17例。另选取同期因子宫其他疾病行子宫切除的40例患者的新鲜正常子宫内膜组织作为研究材料。子宫其他疾病患者年龄40～72岁，平均(55.89±11.25)岁。2组患者年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究符合赫尔本宣言，并经本院伦理委员会批准，患者和其家属均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器 Trizol试剂来自北京天漠科技开发有限公司；研钵来自江苏顺和教学仪器有限公司；三氯甲烷、异丙醇和无水乙醇来自天津市风船化学试剂科技有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)水，lncRNA NNT-AS1、miR-424和内参U6引物来自生工生物工程上海(股份)有限公司；反转录试剂盒来自美国Fermentas公司；实时荧光定量反转录聚合酶链反应(q-PCR)试剂盒来自美国Invitrogen公司；NanoDrop2000来自美国Thermo公司；7500 PCR仪来自美国Bio-Rad公司。

1.3q-PCR检测 取手术切除的新鲜组织立即冻于液氮中，放于研钵中研为粉末后移至EP管中，在管中加入1 mL Trizol试剂裂解，加入200 μL三氯甲烷混匀后4 ℃静置5 min，12 000 r/min离心30 min，获取上层水相溶液与等体积的异丙醇混匀后4 ℃、12 000 r/min离心30 min，弃掉液体，加入无水乙醇4 ℃、12 000 r/min离心30 min，DEPC水溶解RNA，NanoDrop2000测得RNA纯度(A260/A280=2.0左右)和水平。按照反转录试剂盒说明书配制反应体系：含MgCl21 μL的10%DNaseⅠ反应缓冲液1 μL，总RNA 1.0 μg，RNase自由H2O 1～9 μL，总体积为10 μL，37 ℃ 30 min将RNA逆转为cDNA。以cDNA为模板，按照q-PCR试剂盒说明书配制反应体系，Platinum®含有ROX的定量PCR SuperMix-UDG 25 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、荧光探针1 μL、cDNA模板5 μL、ddH2O 17 μL，总体积50 μL。扩增反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，45个循环(95 ℃ 15 min，60 ℃ 30 s)。7500 PCR仪上机检测各样品的循环阈值(Ct)。采用2-ΔΔCt公式以U6基因为内参，计算lncRNA NNT-AS1和miR-424的相对表达水平。引物序列如下：

lncRNA NNT-AS1引物F：5′-AGTTCCACCAAGTTTCTTCA-3′,R：5′-AGGTTTTGCCAGCATAGAC-3′；miR-424引物F：5′-CCAGCAGTTCAAAACATGAATTG-3′,R：5′-TATGGTTGTTCTCGACTCCTTGAC-3′；内参U6引物F：5′-CGTTTTACTTCCTCATACAGCAC-3′,R′5′-GCA-CCAAGAGACCTGTGACA-3′。

1.4随访 采用电话询问或者门诊查询的方式对子宫内膜癌患者进行随访，时间为3个月随访1次，计算患者手术后5年生存率。

2 结 果

2.1不同子宫内膜组织中lncRNA NNT-AS1和miR-424的相对表达水平比较 子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1相对表达水平(1.70±0.31)高于正常子宫内膜组织(1.04±0.33)，而miR-424相对表达水平(0.71±0.24)则低于正常子宫内膜组织(0.97±0.21)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 不同子宫内膜组织中lncRNA NNT-AS1和miR-424的相对表达水平

2.2子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1、miR-424相对表达水平与临床病理特征的关系 子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1相对表达水平与患者的年龄、组织病理类型、肌层浸润程度和病理分级无关(P>0.05)，与FIGO分期、脉管浸润和淋巴结转移有关(P<0.05)；子宫内膜癌组织中miR-424相对表达水平与患者年龄、组织病理类型和病理分级无关(P>0.05)，与FIGO分期、肌层浸润程度、脉管浸润和淋巴结转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1和miR-424相对表达水平与临床病理特征的关系

2.3子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1、miR-424相对表达水平对患者预后的影响 60例子宫内膜癌患者随访结果显示，死亡34例，存活26例，5年生存率为43.33%。

根据子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1、miR-424的相对表达水平将患者分为lncRNA NNT-AS1高表达组(>1.70，26例)、lncRNA NNT-AS1低表达组(≤1.70，34例)和miR-424高表达组(>0.71，33例)和miR-424低表达组(≤0.71，27例)。lncRNA NNT-AS1高表达组死亡17例，存活9例，5年生存率为34.62%；lncRNA NNT-AS1低表达组死亡17例，存活17例，5年生存率为50.00%；miR-424高表达组死亡18例，存活15例，5年生存率为45.45%，miR-424低表达组死亡16例，存活11例，5年生存率为40.74%。见表2。

表2 子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1、miR-424相对表达水平对患者预后的影响

分别绘制lncRNA NNT-AS1和miR-424高、低表达组的Kaplan-Meier生存曲线，采用Log-Rank检验分析显示，lncRNA NNT-AS1高表达组患者的预后比lncRNA NNT-AS1低表达组差(P<0.05)，而miR-424高表达组患者的预后则比miR-424低表达组好(P<0.05)。见图2。

图2 lncRNA NNT-AS1与miR-424高、低表达子宫内膜癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.4单因素和多因素Cox回归分析子宫内膜癌患者预后不良的影响因素 建立COX比例回归模型，以本研究资料为样本，以预后状况为应变量，赋值1=死亡，0=生存，t=生存期。分别采用单因素和多因素COX回归分析可能影响子宫内膜癌患者预后不良的影响因素，结果显示，FIGO分期为晚期、有淋巴结转移、lncRNA NNT-AS1高表达和miR-424低表达是子宫内膜癌患者预后不良的影响因素(P<0.05)，见表3。

表3 Cox回归分析子宫内膜癌患者预后不良的影响因素

2.5子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1相对表达水平与miR-424的相关性 Pearson分析显示，子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1相对表达水平与miR-424呈负相关(r=-0.368，P<0.05)，见图3。

图3 子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1相对表达水平与miR-424的相关性

3 讨 论

子宫内膜癌是全球女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和病死率。近年来，由于肥胖症和代谢性疾病的发病率增加，子宫内膜癌发病率和病死率呈逐年增加的趋势，且发病年龄趋于年轻化，严重威胁女性患者的生命健康[12-13]。子宫内膜癌患者早期症状为不规则阴道流血，容易被患者忽视，由于子宫内膜癌具有高度侵袭性，故诊断时患者已出现肿瘤侵袭和转移，进展为肿瘤晚期[14]。目前子宫内膜癌患者的治疗主要包括手术、化疗、放疗和内分泌治疗，早期患者较晚期患者的疗效较好，但对晚期和复发子宫内膜癌患者的治疗目前仍然是个难题[15]。分子靶向治疗是新近研究的晚期肿瘤重要的新型治疗手段，有研究报道，布立尼布和吉非替尼等一些分子靶向药物对晚期子宫内膜癌患者具有一定的疗效，但是总体临床反应率较低[16]，因此，探寻特异性的新型治疗靶点对子宫内膜癌患者的治疗至关重要。

人类基因组包含非编码DNA，其产物非编码RNA(ncRNA)是可以影响基因调控和肿瘤细胞恶性行为的关键因子，包括长链非编码RNA(lncRNA)和miRNA。lncRNA是一组长度超过200个核苷酸的RNA，由于缺乏开放阅读框，不能翻译成蛋白质，但它们可以通过转录或转录后调控来调节多种病理和生理过程[17]。lncRNA由于与肿瘤发生发展密切相关而受到广泛的关注，其在肿瘤增殖、侵袭、转移和放化疗耐药等生物学行为中发挥重要作用[18]。lncRNA NNT-AS1位于带有3个外显子的人类染色体5p12上，是新型的肿瘤相关lncRNA。lncRNA NNT-AS1在非小细胞肺癌和膀胱癌中表达增加，沉默lncRNA NNT-AS1的表达，均可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力和上皮间质转化[3-4]，但有文献报道在胃癌组织中lncRNA NNT-AS1表达下降，并且lncRNA NNT-AS1的低表达与原发肿瘤的位置和淋巴/血管浸润有关[19]。由此可见，lncRNA NNT-AS1在不同肿瘤中发挥不同的作用，但是其在子宫内膜癌组织中的表达情况未知。本研究发现，子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1的相对表达水平明显高于正常子宫内膜组织，并与患者的FIGO分期、脉管浸润和淋巴结转移相关(P<0.05)。

有研究报道，miR-424在不同的肿瘤中发挥不同的作用，甚至是相反的，在喉鳞状细胞癌和结直肠癌等恶性肿瘤中miR-424表达上调，促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和黏附，并影响细胞周期进程[7-8]。在肝细胞癌中miR-424表达下调，并与甲胎蛋白、TNM分期、肝内转移和肝癌总生存期差有关，miR-424在体内和体外均抑制细胞增殖和侵袭能力[10]。DONG等[11]报道，miR-424表达降低与子宫内膜癌患者预后较差有关，并降低肿瘤细胞侵袭和肿瘤球形成能力。ZHENG等[20]报道，miR-424表达降低与子宫内膜癌患者临床肿瘤分期、细胞分化、淋巴结转移和细胞迁移能力有关，miR-424抑制肿瘤细胞侵袭和迁移能力。本研究发现，子宫内膜癌组织中miR-424的相对表达水平明显低于正常子宫内膜组织，并与患者的病理分期、肌层浸润程度、脉管浸润和淋巴结转移相关(P<0.05)。

最近研究表明，lncRNA可以作为竞争性内源RNA(ceRNA)，与miRNA竞争性相互作用，从而使miRNA远离其靶标mRNA，阻止miRNA发挥调控作用[5]。CHEN等[6]报道，lncRNA NNT-AS1与miR-424结合，通过抑制其表达，在胃癌中发挥促癌基因的作用。Pearson相关分析显示，子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1相对表达水平与miR-424呈负相关(r=-0.368,P<0.05)，表明lncRNA NNT-AS1在子宫内膜癌中可能通过miR-424发挥作用，但具体的作用机制还有待基础实验进行研究。进一步单因素和多因素Cox回归分析发现，病理分期晚期、有淋巴结转移、lncRNA NNT-AS1高表达和miR-424低表达是影响子宫内膜癌患者预后不良的危险因素(P<0.05)，且生存分析发现，lncRNA NNT-AS1高表达和miR-424低表达的患者生存情况较差，提示二者与患者的预后密切相关。

综上所述，子宫内膜癌组织中lncRNA NNT-AS1呈高表达，miR-424呈低表达，二者的相对表达水平呈负相关，lncRNA NNT-AS1可能通过miR-424发挥作用。lncRNA NNT-AS1和miR-424是子宫内膜癌患者预后不良的影响因素，lncRNA NNT-AS1/miR-424轴可能是子宫内膜癌潜在的治疗靶点。