脑脊液ECLIA与FTA-ABS检测在NS诊断中的应用价值研究

应姗珊，罗 岚，邓杰伦，王远芳，李冬冬

四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041

神经梅毒(NS)是梅毒螺旋体(TP)感染累及神经系统时出现脑膜、大脑、血管或脊髓等损伤的一组临床综合征，但NS目前确诊较困难，容易被漏诊与误诊[1-2]。2020版《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南》推荐NS脑脊液(CSF)检查首选试验为梅毒性病研究实验室试验(VDRL)和荧光螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)，相对于广泛用于临床的电化学发光免疫分析(ECLIA)，FTA-ABS和VDRL在我国医院开展较少[3]。本研究使用2种方法(ECLIA和FTA-ABS)来检测CSF中3类梅毒特异性抗体[梅毒特异性总抗体(anti-TP)，梅毒特异性抗体免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)]，探索ECLIA和FTA-ABS在NS CSF检测中作为初筛试验应用的价值[4]。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年1月至2020年1月于本院就诊的梅毒确诊患者124例作为研究对象，患者多就诊于神经内科或感染科，多伴有NS相关神经症状或临床诊断确诊/怀疑NS。以CSF VDRL结果作为诊断NS的金标准，将患者分为NS组和非NS组。NS组纳入标准：满足中国疾病预防控制中心发布的《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南(2020年)》[3]NS疑似条件且CSF VDRL阳性的患者。非NS组纳入标准：血清梅毒初筛、梅毒血清学试验(TURST)及梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)皆阳性，而CSF VDRL阴性的患者。本研究经本院生物医学伦理审查委员会批准。

1.2方法 收集NS组和非NS组患者CSF标本，排除明显血性的CSF，CSF性状均正常。将标本置于-80 ℃标本冰箱保存备用。质量控制严格按照说明书执行，试验操作步骤和结果判读方法如下。

1.2.1采用VDRL检测梅毒非特异性抗体 相关试剂来自美国BD公司。将CSF标本从冰箱取出后置于室温下复温30 min，在反应玻片2～4孔加入50 μL 0.9%NaCl溶液，在第1、2孔加入50 μL待测标本，将第2孔标本与0.9%NaCl溶液轻轻吹打混匀并吸取50 μL到第3孔，重复操作，直到最后一孔吸取50 μL标本弃用完成稀释。混匀抗原悬液(每日制备新鲜抗原悬液)并在每个反应孔垂直悬空加入10 μL。将反应玻片放置于旌派仪器有限公司(上海)梅毒旋转振荡器XK96-9上，180 r/min振荡4 min。使用Olymbus公司(日本)光学显微镜BX43在10倍物镜下观察结果。结果判读：根据说明书将结果分为中-大团阳性(R)、小-弱团阳性(WR)和无凝集或非常轻微的阳性(NR)，第1次检测标本最高稀释倍数为1∶8，如果最后一孔依然为阳性则继续稀释，最后以显微镜中结果为R的最大滴度为最终结果。

1.2.2采用ECLIA检测CSF中anti-TP CSF标本从冰箱取出后置于室温下复温30 min，去盖后上架编号并使用德国Roche公司Cobas e801电化学发光免疫自动分析仪检测，检测使用的配套试剂购自德国Roche公司。结果判读：记录每个标本临界值指数(COI)值，采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析COI值的最佳临界值，COI值<最佳临界值为无反应性即anti-TP抗体阴性，COI值≥最佳临界值为有反应性即anti-TP抗体阳性。

1.2.3采用FTA-ABS检测CSF中IgG、IgM 相关试剂来自德国欧蒙公司。按照试剂说明书要求准备磷酸盐缓冲液(PBS)-吐温缓冲剂、FTA-ABS吸附剂和RF吸附剂。标本复温后使用FTA-ABS吸附剂稀释(IgM检测还需RF吸附剂稀释)并放置于干式恒温金属浴37 ℃孵育30 min。经加样、温育、冲洗、浸泡，加二抗再重复温育、冲洗、浸泡，最后封片，使用荧光显微镜EUROStar Ⅲ Plus判读荧光模型。结果判读：质控芯片上代表相应抗体的微点出现阳性，反应区全片出现均匀的TP发光即为阳性；质控芯片上代表相应抗原微点出现阳性，且反应区不出现荧光或出现非特异性荧光为阴性；质控芯片无荧光，检测结果不可靠应重新试验。

1.2.4清蛋白商(QAlb) 回顾性分析患者实验室检查结果，选取留存标本同日患者CSF、血清清蛋白检查结果，并按照公式[QAlb=CSF清蛋白/血清清蛋白]计算QAlb。根据各年龄段参考值进行结果判读：0～15岁，QAlb<5.0×10-3；>15～40岁，QAlb<6.5×10-3；>40岁，QAlb<8.0×10-3。

1.3统计学处理 使用EXCEL 365统计数据，IBM SPSS Statistics 22.0和GraphPad Prism 8.0.2.263软件处理分析数据，MedCalc 15.2.2绘图。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验。采用ROC曲线及曲线下面积(AUC)分析CSF梅毒特异性抗体检测方法对NS的诊断效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1梅毒患者CSF VDRL检测结果 NS组患者共36例，其中女8例，男28例，2例伴人类免疫缺陷病毒(HIV)感染；非NS组患者共88例，其中女40例，男48例，5例伴人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。

2.22组患者CSF中梅毒特异性抗体的阳性检出率比较 NS组CSF中anti-TP、IgM、IgG的阳性检出率高于非NS组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组患者CSF中梅毒特异性抗体的阳性检出率比较[n(%)]

2.3CSF中3种梅毒特异性抗体检测对NS的诊断效能 绘制anti-TP、IgM、IgG诊断NS的ROC曲线，ECLIA检测anti-TP诊断NS的最佳临界值为19.1，AUC为0.964(95%CI：0.914～0.989)，特异度为94.44%，灵敏度为92.05%，约登指数为0.864 9。以COI>19.1为阳性，ECLIA检测anti-TP诊断NS的AUC大于FTA-ABS检测IgM和IgG诊断NS的AUC(P<0.05)。见表2。

表2 3种梅毒特异性抗体对NS的诊断效能

2.4VDRL滴度与CSF中IgM阳性结果的相关性 随着VDRL滴度上升，CSF中IgM结果呈阳性的患者比例增加，但发现1例非NS患者CSF IgM结果阳性，见表3。

表3 VDRL不同滴度CSF中FTA-ABS-IgM阳性分布情况

2.5QAlb不同的CSF中IgM结果分布情况 排除年龄和CSF、血清清蛋白数据不全标本后，纳入统计数据的患者NS组21例，非NS组65例。QAlb与CSF中IgM结果联合分析发现，QAlb结果在NS组和非NS组分布差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 QAlb不同的CSF中IgM结果分布情况比较(n)

3 讨 论

多数患者神经系统被TP侵犯时无症状，无法提示临床医生怀疑NS感染，易错过NS早期诊断和治疗的时机[5]。在梅毒发展到Ⅱ、Ⅲ期时，TP数量减少但破坏力增强，预后变差[6]。血脑屏障功能正常时，血中的IgM等大分子蛋白质无法进入CSF，CSF中的IgM皆由鞘内免疫反应合成，提示NS活动性感染；而血脑屏障异常时，CSF中的IgM可能来源于血液或鞘内合成，无法判断是否为NS活动性感染。本试验使用QAlb来评价血脑屏障功能完整性，以15岁和40岁为节点，不同年龄段QAlb参考范围不同，QAlb也可提示神经系统疾病感染类型，QAlb轻度升高(QAlb<20×10-3)常见于急、慢性病毒感染，多发性硬化，NS等[7-8]。

在NS的CSF检测中，普遍认为CSF VDRL具有较高的特异度，但其灵敏度较低[9]。2010年美国疾病控制与预防中心(CDC)发布的性病治疗指南认为CSF VDRL阳性是实验室确诊NS的必要条件[10]，并且只有在确保CSF标本无明显的血液污染的前提下，VDRL阳性才具有临床价值。但VDRL的标本检测有效时限短且试剂需要提前配置、试剂盒购买困难等缺点限制了其临床检验的实用性。根据《梅毒、淋病和生殖道沙眼衣原体感染诊疗指南(2020年)》[3]NS疑似病例与确诊标准，NS确诊需综合临床表现、血清学检查、CSF蛋白、白细胞以及梅毒抗体检测综合判定。FTA-ABS操作较复杂，虽欧蒙公司已有间接免疫荧光法自动化仪器，但仍需人工读片。FTA-ABS可分别检测梅毒特异性抗体IgG和IgM，具有作为NS CSF筛查试验的潜质。根据目前的研究，CSF梅毒血清学试验的灵敏度高，特异度差，很难直接作为确诊依据，FTA-ABS和VDRL主要用于阴性排除[11]。

本研究对124例梅毒患者进行了CSF VDRL检查，确诊NS 36例，NS发生率为29.0%。但VDRL灵敏度低，存在一定的假阴性率。ECLIA检测anti-TP是目前广泛应用于临床的梅毒初筛指标，方法简单且大多数医院可进行全自动检测。该方法灵敏度较高，根据ROC曲线分析，当临界值为19.1时ECLIA对NS检测的诊断效能最佳，AUC为0.964(95%CI：0.914～0.989)，特异度为94.44%，灵敏度为92.05%，约登指数为0.864 9。但本研究样本数量不足以证明19.1的最佳临界值具有代表性，后续需扩大研究样本数补充验证ECLIA在CSF中的最佳COI值，可尝试设置灵敏度更高的发光值为临界值。

FTA-ABS作为特异度较高的一种权威的CSF梅毒特异性抗体检测试验，与免疫印迹法(WB)相比特异度相近，但成本更低，临床应用价值更高[12]。本研究中共有11例CSF标本IgM和IgG检测均阳性，IgM阳性检出率明显低于IgG。经数据分析发现，FTA-ABS检测IgG可以很好地用于区别NS和非NS，灵敏度和特异度都较高，分别为97.22%和78.41%，可以考虑作为NS的筛查指标。FTA-ABS检测IgM的阳性检出率低，灵敏度仅有30.56%，但特异度较高达98.86%。而IgG可以穿过血脑屏障，无法区分CSF中IgG是否由鞘内合成，可以用抗体特异性指数来反映病原特异性抗体是否为鞘内产生[13-14]。

血脑屏障功能正常时，CSF中的IgM只能鞘内合成，理论上CSF IgM诊断NS较准确。IgM只在梅毒活动期存在，不能提示既往梅毒感染，所以理论上CSF IgM在提示既往感染时存在一定的假阴性率，需要和IgG检测联合使用。VDRL滴度高的标本IgM阳性检出率比VDRL滴度低的标本更高。

QAlb正常时，CSF IgM结果阳性则认为NS可能性较高，CSF IgM结果阴性则认为NS可能性较低。QAlb升高时，血脑屏障功能完整性被破坏，此时若IgM检测结果为阳性，无法判断出CSF中IgM是否由鞘内合成，此时可以参考抗体特异性指数进行诊断。当QAlb升高且CSF IgM为阴性时，存在两种可能：(1)NS既往感染患者，血清及CSF中不含有或含有少量IgM；(2)非NS既往感染患者，血清梅毒抗体IgM水平低或无。

非NS组中有1名患者CSF VDRL检测阴性，但使用FTA-ABS检测CSF IgG与IgM结果皆为弱阳性，ECLIA检测anti-TP结果为阳性，患者CSF TPPA滴度1∶320，CSF TRUST阴性，查阅患者病历后发现该患者同时伴有HIV感染，CSF中未查见白细胞，且无神经系统受损临床症状，不符合NS疑似标准，排除其感染可能，该患者CSF IgG升高可能与血清TP IgG高滴度有关(血清TPPA为1∶10 240)，该患者无CSF生化结果，不能判断QAlb是否升高，CSF中的IgM可能由血清产生。

综上所述，ECLIA检测CSF中anti-TP诊断NS的灵敏度较高，自动化程度高，操作简单，可以考虑作为初筛试验，但本研究样本通量不大，计算的COI值需要更多数据验证，具体的应用效能评价需进一步研究；FTA-ABS检测CSF IgG诊断NS的灵敏度和特异度都较好，可以考虑作为阴性排除试验，但成本较高，手工操作繁复。FTA-ABS检测CSF IgM诊断NS的灵敏度低，但对NS的现症感染具有提示意义，排除血脑屏障损伤后诊断NS的结果更可信，但由于试验结果的荧光强度多数较低，人工判读差异较大，易漏诊。