微小 RNA-4463 对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的影响

高栋梁，张雷，张宏峰，杨喜明

作者单位：延安大学附属医院烧伤整形手外科，陕西 延安 716000

瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕，主要表现为皮肤损伤修复过程中结缔组织快速增殖，成纤维细胞过度生长，胶原大量沉积，并伴有炎症以及组织损伤等。瘢痕疙瘩生长在面部等部位严重影响病人的容貌，给病人带来极大的生活困扰。目前，瘢痕疙瘩的发病机制尚不十分清楚，临床缺乏特异性的治疗方法。因此，探究瘢痕疙瘩发生发展过程中的分子机制，为临床寻找新的防治方 法具有重要意义。研究结果表明，阻碍成纤维细胞的恶性增殖可抑制瘢痕疙瘩的生长。 微小 RNA（microRNA，miRNA）是一种具有广泛作用的非编码 RNA，主要调控转录后的靶基因水平，影响多种人类疾病的发生发展。研究证实，miRNA 的表达量异常与多种皮肤病如瘢痕疙瘩的病理进程紧密相关。研究显示，miR-4463 在瘢痕疙瘩组织中较正常对照明显降低，但其具体的作用机制尚不明确。本研究拟通过探究 miR-4463 对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭的影响及分子机制，为临床阐明瘢痕疙瘩发生发展分子机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

胎牛血清 、DMEM 培养基 、Transwell 小室购自美国 Corning 公司，Trizol 试剂、Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen 公司 ，定量聚 合酶链反应（qPCR）试剂盒、cDNA 逆转录试剂盒购自中国Roche公司 ，细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）购自上海碧云天生物有限公司；Mataigel 胶购自美国 BD 公司，miR-4463 模拟物对照质粒、miR-4463 模拟物均购自广州锐博生物科技有限公司，荧光素酶试剂盒购自美国 Sigma 公司。荧光定量 PCR 扩增仪购自美国 ABI 公司，多功能酶标仪购自美国 Applied Biosystoms 公司。

1.2 细胞的收集与培养

收集延安大学附属医院2017年 12月至 2019年 6月整形手术病人 40例，每例切除瘢痕疙瘩组织 1 个以及邻近正常皮肤组织 1个，其研究均获得病人或其近亲属的同意，且均经过病理学检验确认为瘢痕疙瘩。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求 。病人年龄在20～35岁，均未接受任何瘢痕相关治疗。收集的样本置于无菌条件下清洗，使用组织块贴壁法分离瘢痕疙瘩成纤维细胞，经鉴定符合实验要求，加入含10% 胎牛血清 DMEM 培养基孵育，置于 5% 二氧化碳、37 ℃培养，每 2 天加入胰酶消化、传代。

1.3 细胞的转染

选取对数期 3～5 代瘢痕疙瘩成纤维细胞，采用随机数字表法分为对照组、miR-NC组、miR-4463 组。常规培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞作 为 对 照 组 ，miR-NC 组 、miR-4463 组 根 据 Lipofectamine 2000 说明书将 miR-4463 模拟物对照质粒和 miR-4463 模拟物分别转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞，然后置于 37 ℃继续培养 48 h。取临床手术中正常皮肤标本，应用组织块法进行培养，用 2.5 g∕L 胰蛋白酶进行消化传代，实验用第3～8 代处于对数生长期的细胞。

1.4 qPCR 实验

各组瘢痕疙瘩成纤维细胞转染后培养 48 h，收集 5×10∕孔置于 6 孔板中，待细胞密度约为 80%～90%，加入 Trizol 试剂，提取瘢痕疙瘩成纤维细胞总 RNA，逆转录为互补 DNA（cDNA），反应条件为 50 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。引物均由上海生工生物公司设计、合成，如下表所示。miR-4463 以U6 为 参 照，Col 1 A1 和 Col 3 A1 以 GAPDH 为 参 照，根据 qPCR 试剂盒指示检测 miR-4463 的表达量，反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，57 ℃ 45 s，35 个循环，采用 2法计算 miR-4463 的表达量。

表1 引物序列

1.5 CCK-8 实验

将各组 1×10个瘢痕疙瘩成纤维细胞接种至 96 孔板，加入适量培养基，分别培养 24 h、48 h、72 h，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，37 ℃继续孵育 2 h，酶标仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞 450 nm吸光度。

1.6 Transwell 实验

将 Mataigel 基质胶稀释液提前加入 Transwell 上室膜，风干、备用；收集各组转染48 h 的瘢痕疙瘩成纤维细胞，在胰酶的介导下将其密度调整为 1×10∕mL；吸取 200 μL 瘢痕疙瘩成纤维细胞悬液加入 Transwell 上室，下室中加入 600 μL、含 10% 胎牛血清的培养基，37 ℃培养 48 h；取 5 个区域计数，计算平均值即为侵袭细胞数；检测迁移细胞数时，Transwell 上室膜不加入 Mataigel 基质胶。

1.7 miR-4463靶基因的预测和验证

Targetscan（http：∕∕www.targetscan.org∕vert_71∕）预测 miR-4463与 B 细胞淋巴瘤 -2（Bcl-2）Bcl-2 相关的致病基因BAG4 的靶向关系。野生型（BAG4-wt）荧光素酶报告载体（含有与miR-4463结合的位点）和突变型（BAG4-mut）荧光素酶报告载体（含有突变位点）均购买自美国 Sigma 公司，分别与 miR-NC 质粒、miR-4463 模拟物共转染，37 ℃培养 48 h，在荧光素酶试剂盒说明书指示下测定瘢痕疙瘩成纤维细胞中的荧光素酶相对活性。

2 结果

2.1 miR-4463 在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量

与人正常成纤维细胞细胞（1.000±0.071）相比，miR-4463 在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达量（0.218±0.036）明显降低（

t

=29.470，

P

＜0.001）。

2.2 转染 miR-4463 模拟物对瘢痕疙瘩成纤维细胞中 miR-4463 表达量的影响

与对照组（1.000±0.073）相比，miR-NC 组瘢痕疙瘩成纤维细胞中 miR-4463 表 达量（1.026±0.085）差异无统计学意义（

P＞

0.05），但 miR-4463 组细胞中 miR-4463 表达量（3.313±0.242）明显增加（

F

=669.515，

P

＜0.001）。

2.3 上调 miR-4463 对瘢痕疙瘩纤维化相关基因表达、细胞增殖、迁移及侵袭的影响

与对照组相比，miR-NC 组瘢痕疙瘩成纤维细胞中 Col 1 A1、Col 3 A1 表达量、细胞增殖、迁移及侵袭差异无统计学意义（

P＞

0.05），但 miR-4463 组细胞中 Col 1 A1、Col 3 A1 表达量、增殖活性、迁移及侵袭数明显降低（

P

＜0.05）。见表1、图1。

图1 上调miR-4463对人瘢痕疙瘩成纤维细胞细胞迁移、侵袭的影响（结晶紫染色×200）

2.4 miR-4463 靶基因的预测和验证

BAG4 基因3’端非翻译区域（3’UTR）部分碱基可于 miR-4463特异性结合，见图2。跟 miR-NC 与 BAG4-wt 共转染（1.000±0.065）相比，miR-4463 模拟物与 BAG4-wt 共转染降低瘢痕疙瘩 成纤 维 细胞 荧光 素酶相 对活 性（0.435±0.048）（

t

=20.977，

P

＜0.001）；但 miR-4463 模拟物与 BAG4-mut共转染（0.994±0.081）跟 miR-NC 与 BAG4-mut 共 转染（1.000±0.083）相比，对瘢痕疙瘩成纤维细胞荧光素酶相对活性无明显影响（

t

=0.155，

P

=0.879）。

图2 Targetscan 预测 miR-4463 与 BAG4 的靶向关系

3 讨论

瘢痕疙瘩是一种组织在创伤或感染后过度修复、纤维化的良性肿瘤，其病理进展与成纤维细胞增殖调控异常有关。瘢痕疙瘩发生发展主要表现为成纤维细胞增殖活性增强，但其发病机制尚不明确，治疗手段多样，但效果不令人满意，已经成为整形外科亟待解决的主要难题之一。越来越多的研究表明，瘢痕疙瘩的发生、发展与 miRNA 表达量异常紧密相关。

Col 1 A1 和 Col 3 A1 基因是一种胶原表达的相关基因，在瘢痕疙瘩发生发展中起到重要作用，Col 1 A1 和 Col 3 A1 基因过表达可引起成纤维细胞的增殖。

miR-4463 是近年来发现的一种 miRNA，通过调控细胞的增殖、侵袭影响人类疾病的发生发展。研究表明，采用 miRNA 芯片技术检测发现，miR-4463在动脉硬化闭塞症病人中表达量明显降低，进一步过表达 miR-4463 抑制低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞迁移，从而参与动脉硬化闭塞症的病理发生过程。另外研究表明，miR-4463 可通过靶向调控下游靶基因（细胞迁移相关蛋白 AMOT）表达来调控血管平滑肌细胞迁移，为探究血管疾病的新疗法提供实验依据。除此之外，miR-4463 可增强过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞氧化应激反应，并促进其凋亡，表明 miR-4463 在血管疾病中发挥重要作用。但研究发现，miR-4463 在瘢痕疙瘩病人样本组织中表达量异常，表明 miR-4463 可能参与瘢痕疙瘩病理 发展过程。因此本实验通过 qPCR 检测 miR-4463 在瘢痕疙瘩成纤维细胞、人正常成纤维细胞中的表达量，结果显示，miR-4463 在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量明显降低，与前人研究在组织中的表达量具有一定的相似性；进一步上调 miR-4463 在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量，结果显示，过表达 miR-4463 抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，降低其侵袭、迁移能力，表明 miR-4463 可通过影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学特性，阻碍瘢痕疙瘩组织的生长。

表1 上调 miR-4463 对瘢痕疙瘩纤维化相关基因表达的影响∕

BAG4 是 BAG 家族蛋白成员之一，可靶向结合于 B 细胞淋巴瘤∕白血病 -2（B cell lymphoma∕lewkmia-2，Bcl-2），阻碍细胞凋亡信号的传导，降低细胞的凋亡率。近年来的研究发现，BAG4 在多种肿瘤组织如非小细胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤中表达量异常，参与肿瘤的发生、转移过程。研究证实，BAG4 在瘢痕疙瘩病理演进过程中表达量明显上调，表明 BAG4 参与瘢痕疙瘩的病理进程。在本实验中，为进一步探究 miR-4463 抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制，通过在线数据库预测发现，BAG43’UTR 区域含有部分碱基可特异性结合于 miR-4463，表明 BAG4 可能是 miR-4463的下游靶基因；进一步通过双荧光素酶验证发现，miR-4463 与含有结合位点的 BAG4 野生型载体共转染可降低细胞中的双荧光素酶相对活性 ，而 与BAG4 突变型载体共转染对细胞中双荧光素酶相对活性无显著影响，表明 miR-4463 可通过特异性结合于 BAG4，从而降低细胞中的双荧光素酶相对活性，证实 BAG4 是 miR-4463 的下游靶基因。

综上所述，miR-4463 在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量显著降低；过表达 miR-4463 可抑制细胞外基质中纤维化相关胶原基因的表达，抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭、迁移，其作用机制可能是通过靶向调控 BAG4 表达量，为瘢痕疙瘩临床特异性治疗方法的探究提供实验依据，未来会进一步深入研究 miR-4463 的作用机制以及探究其在临床样本中的作用。