不同聚合度原花青素分离制备的研究进展

徐佳慧,陈明舜,陈 军,张成浩,李 信,李 俶

(南昌大学食品学院,江西南昌 330000)

目前国内外提取原花青素的方法主要有溶剂萃取[10]、超临界流体萃取[11]、微波辅助萃取[12]、超声波辅助萃取[13]以及酶解法[14]等。原花青素粗提物中含有很多杂质,需进一步分离才能得到纯度较高的产品。目前分离纯化方法主要有溶剂萃取分离法、层析法[15]、吸附法[16]等。而一般来说,原花青素的分级方法可分为两类:第一类是液-固色谱法,包括正相液相色谱、反相液相色谱、凝胶过滤色谱和亲水相互作用色谱等;第二类是液-液色谱法,包括离心分离色谱、高速逆流色谱和渐进溶剂沉淀法等[17]。另外,常用紫外分光光度法、香草醛检测法、钼酸铵分光光度法、铁盐催化比色法和高效液相色谱法等来测定原花青素含量[18]。通过分析产物的紫外吸收光谱、质谱以及核磁共振谱鉴定并确认其组成单元,再计算出原花青素的平均聚合度。

本文将从液-固色谱法和液-液色谱法这两类方法的角度综述常见的不同聚合度原花青素的制备方式,以期为更好地制备不同聚合度的原花青素提供理论依据和指导,为进一步研究原花青素聚合度与其生理活性的相关性创造可能性。

1 液-固色谱法制备原花青素

液-固色谱法是以固体吸附剂为固定相,液体为流动相的常见分离方法,其分离原理是根据吸附于固定相中的各组分在液体流动相中分配系数的不同,最终固液相对平衡而达到分离目的[19]。在正相色谱柱中,原花青素按其聚合度洗脱,硅胶珠常作为柱材。然而,在反相色谱柱中,原花青素按其极性洗脱,具有相同聚合度的原花青素同分异构体之间可能具有不同的保留时间[20]。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法,常用的柱材有大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40等,由于其柱材相对易得、装柱简单、使用方便、对高分子物质分离效果好,因此目前应用最为广泛[21-22]。

1.1 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)

研究表明,利用HPLC分级制备不同聚合度的原花青素,其原理是原花青素聚合度越高,活性酚羟基数量越少,分子极性越小,在非极性色谱柱上吸附得越紧密,流动相较难洗脱,样品出峰时间晚[23]。由于该方法进样量少,可以测定一定聚合度范围内原花青素含量,因此其在原花青素分级中多用于定性、定量分析。该方法的不足之处在于原花青素成分具有复杂性,同时受到对照品和分析手段的限制,目前还不能把其中的每一个成分单独分离出来,只能得到一定聚合度范围内的原花青素,因此,在分级前应对样品进行预处理,如利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20、Sephadex G25、Toyopeah TSK HW40等柱层析方法或者薄层层析法,以免影响分级效果[24-25]。

1.2 大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂法具有选择性优良、进样量大、重复使用方便及理化性质稳定等优点,在天然物质分离纯化中得到较多的研究和应用。利用大孔吸附树脂法分级原花青素的原理是原花青素的聚合度越高,单位质量的原花青素所具有的活性酚羟基数量越少,极性越小,分子的亲水性减弱[26]。同时,原花青素聚合度越高,分子空间构象越复杂,分子体积增大,与树脂之间的作用点增多,需要更高浓度的乙醇溶液才能洗脱[27]。

姜倩等[28]采用AB-8大孔吸附树脂分离肉桂原花青素,用体积分数分别为10%、50%、70%、100%的乙醇溶液洗脱,结果发现,随着乙醇体积分数的增大,其洗脱液中原花青素的聚合度越高,另外,10%乙醇洗脱液中原花青素的抗氧化活性最强,对DPPH·的清除率为0.91 g/L。朱靖蓉等[29]对比了AB-8、ADS-8和S-8型三种大孔吸附树脂对原花青素分离纯化的效果,结果表明,ADS-8大孔吸附树脂对葡萄籽原花青素吸附能力最强,产物纯度大于95%,分离效果最好。白欢欢等[30]利用AB-8大孔吸附树脂分离花生红衣原花青素,结果发现体积分数为20%和40%的乙醇溶液洗脱得到的产物均为低聚原花青素,且均为A型原花青素。

另外,也有较多研究通过大孔吸附树脂法与其他分离方法相结合的方式对原花青素进行分离或分级。Sui等[31]通过AB-8柱层析和Toyopearl HW-40柱层析相结合制备荔枝皮中(-)-儿茶素和寡聚原花青素,结果表明表儿茶素和A型原花青素三聚体的产率最高。Dong等[32]以花生皮和柿子单宁裂解产物为原料,先后用AB-8柱层析、Toyopearl HW-40柱层析进行洗脱,结果显示二者所制备的A型原花青素寡聚体含量均较高。进一步地,在体内和体外实验中,发现A型和B型二聚体均具有较高的抗氧化能力,且呈剂量依赖性,一般情况下,B型二聚体相比于具有相同亚基的A型二聚体有更高的自由基清除能力,但在组织或脂质系统中,A型二聚体与B型二聚体具有相似的抗氧化能力。大孔吸附树脂法常用来分离制备A型低聚原花青素,分离效果较好,应用广泛,但其吸附效果易受样品流速和溶质浓度的影响,所得产物纯度较低,在多种分离技术相结合的分级方式中,大孔吸附树脂法常用作进一步纯化和初步分离。

1.3 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离法

Sephadex LH-20是一种常用的葡聚糖凝胶填料,具有使用简便、产物纯度高、适用范围广等优点[33]。Sephadex LH-20的分级原理是在Sephadex LH-20柱中,组分极性越大,保留能力越弱,最先被洗脱,而原花青素随着聚合度的增高,分子极性降低,因此低聚合度的原花青素先出柱,Sephadex LH-20柱能起到分配色谱的作用[34]。

Sephadex LH-20柱分离法是近几年用于原花青素分离分级较多的方法。雷斗剑[35]利用Sephadex LH-20对火棘果原花青素提取物进行分离,得到8种具有不同聚合度的原花青素组分,其聚合度范围为5～16。Ling等[36]用Me2CO/H2O(7∶3)萃取莲子房原花青素,后用Sephadex LH-20柱层析进行分离,得到的产物纯度大于98%,质谱分析表明,该产物为原花青素单倍体、二聚体和四聚体的混合物,其中二聚体的含量最高。通过抑制脂氧合酶活性和对自由基清除率影响的实验发现,0.1%的莲子房原花青素产物在大豆油体系中具有较强的抗氧化活性,在相同浓度下优于二丁基羟基甲苯。Fu等[37]从山竹果果皮中提取低聚原花青素,用Sephadex LH-20柱分离得到0.66%的产率(干物质),且分离出的原花青素具有较强的过氧自由基清除能力,其清除能力为1.7×104μmol TE/g。Gong等[38]经两轮Sephadex LH-20柱层析分馏荔枝果皮得到S3片段,其进一步分离得到四种不同的A型或B型表儿茶素低聚物,经实验发现,这些低聚物的抗氧化活性和对人肺癌细胞A549增殖的抑制作用均强于荔枝花青素。马烨[39]用Sephadex LH-20柱分离纯化后的红米原花青素,得到平均聚合度为4.14的六个原花青素组分,进一步研究发现,平均聚合度在2.8～8.6范围内的前五个红米原花青素组分抗氧化活性与聚合度呈正相关,但平均聚合度为12.7的最后一个组分抗氧化活性显著降低。

另外,也有较多研究通过Sephadex LH-20柱分离法与其他分离方法相结合的方式对原花青素进行分离或分级。李倩[40]利用大孔吸附树脂对南酸枣皮原花青素提取物进行初纯化,再利用不同浓度甲醇溶液,通过葡聚糖凝胶LH-20层析柱对南酸枣皮原花青素提取物进行纯化分级,得到的五个原花青素组分平均聚合度为1.9～9.3。进一步研究发现,随着原花青素组分平均聚合度的增加,其对结肠癌细胞增殖和对α-淀粉酶、α-葡糖苷酶的抑制作用随之增强,但抗氧化活性随之减弱,这可能是由于分子量大的原花青素,不易穿过细胞膜进入细胞内发挥抗氧化作用。周蒙等[41]通过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱和快速蛋白液相色谱分离纯化黑荆树粗提物,得到纯度大于90%、得率大于13%的黑荆树原花色素二聚体,进一步研究发现,该原花色素二聚体的抗氧化活性高于原花青素单体标样。Wiesneth等[42]将LH-20、MCI-、Diol-和RP-18-phases色谱联合分离沙柳粗提物,制得原花青素B1、B2、B3、B4、C1、表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(4β→8)-儿茶素和表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素-(4β→8)-儿茶素等化合物。Hellenbrand等[43]开发了一种将Sephadex LH-20层析与制备高效液相色谱相结合的方式,对贯叶连翘中的金丝桃的丙酮-水提取物进行分级,得到聚合度从3到10的原花青素。Ito等[44]采用Sephadex LH-20柱层析和反相制备高效液相色谱法,从黑豆种皮中分离出原花青素低聚物(二聚物到四聚物)。Leppä等[45]采用Sephadex LH-20柱层析法与半制备液相色谱相结合的方式,可控制性地从11种不同植物中分离出几十个化学和色谱良好的PC组分。综上所述,Sephadex LH-20柱分离法分级效果好,可分离低聚和高聚原花青素,但价格偏贵。

1.4 Toyopearl HW-40柱分离法

Toyopearl HW-40和Sephadex LH-20柱分离法一样,也是一种常见的尺寸排阻色谱,在原花青素的分级中发挥着分子筛的作用,分级后所得产物纯度较高。Toyopearl HW-40由乙烯醇和甲基丙烯酸酯共聚而成的半坚硬的球状体组成,相对而言,Sephadex LH-20柱价格更高,分级效果更好,很少研究报道单独使用Toyopearl HW-40柱进行分级。但二者尺寸不同,Toyopearl HW-40孔径更小,是脱盐的理想选择,而Sephadex LH-20适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。Toyopearl HW-40对原花青素的分级原理是Toyopearl HW-40表面的-OH具有亲水性,能吸附较多亲水性官能团[46]。不同聚合度的原花青素具有不同的分子量,而Toyopearl HW-40柱起到了分子筛的作用。Rosales-Castro等[47]用乙酸乙酯对西葫芦树皮粗提取物进行液体分配,得到有机提取物,然后用柱层析法(Toyopearl HW-40F)分级,在产物中检测、鉴定出了聚合度分别为2、3、4的低聚原花青素,并通过测定发现这些低聚物具备较高的抗自由基活性。Rosales-Castro等[48]用相似的方法从杜鹃栎树皮中分离出低聚原花青素,均表现出最佳的抗氧化能力。

目前相对常见的是将Toyopearl HW-40柱分离法与其他分离方法相结合的方式对原花青素进行分级。Kawahara等[49]用Amberlite XAD-1180N、Toyopearl HW40F和Sepacore C-18反相色谱柱相结合的方式将红小豆中的原花青素浓缩成5个馏分,并鉴定这些组分分别为(表)儿茶素六聚物、七聚物和八聚物、没食子儿茶素-(表)儿茶素五聚物和(表)没食子儿茶素-(表)儿茶素六聚物。这些组分对人PC-3前列腺癌细胞具有显著的抗癌活性,它们还能显著抑制脂肪酸结合蛋白基因的表达,该基因在前列腺癌细胞的生长和转移中起重要作用。Sei-ichi等[50]采用相似的方法得出了相近的结果,其利用Amberlite XAD-1180N、Sephadex-LH-20、Toyopearl HW-40F和反相高效液相色谱对葡萄茎提取物中原花青素组分进行了纯化,并测定了两种关键化合物为没食子儿茶素-(表儿茶素)7没食子酸盐。其中没食子儿茶素-(表儿茶素)7没食子酸酯(化合物1)在PC-3前列腺癌细胞中具有显著的抗癌活性。周玮婧等[51]将荔枝皮原花青素浸提物通过AB-8大孔树脂纯化,并进一步通过Toyopearl HW-40S树脂层析分级处理,得到荔枝皮原花青素低聚体,其主要成分为(-)-表儿茶素、A型原花青素二聚体和A型原花青素三聚体。Schmidt等[52]以野蓝莓为原料,分别采用Toyopearl和Sephadex LH-20柱层析法,采用液体真空法和开放柱层析法将其分离为富含原花青素的组分,得到的两个原花青素组分平均聚合度为3.25和5.65,均能抑制引起尿路感染的大肠杆菌的粘附。另外,只有聚合度为5.65的部分对人前列腺和小鼠肝癌细胞系有明显的抗增殖活性。Xiao等[53]将澳洲青苹果(Granny Smith apples,GSE)粗提物通过ADS-17大孔树脂柱纯化,得到了该苹果的原花青素提取物,并进一步在Toyopearl TSK HW-40s柱上,按聚合度对GSE进行了分级,得到原花青素B2和C1。利用Toyopearl HW-40柱分离法与其他分离方法相结合的方式对原花青素进行分级,所得原花青素产物纯度更高,分级效果更理想。

2 液-液色谱法制备原花青素

液-液色谱法是流动相和固定相均为液体的分离方法,它依赖于PC在不同溶剂体系中分配系数的不同,常需要与液-固色谱法相结合来检测目标物质,是目前分离分级原花青素较新的方法。

2.1 高速逆流色谱法(High-speed Countercurrent Chromatography,HSCCC)

高速逆流色谱法利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象,使两个互不相溶的溶剂体系在高速旋转的螺旋管中单向分布,从而实现不同溶解分配系数的溶质在两相溶剂中的高效分离[54-55]。Shibusawa等[56]用HSCCC法以乙酸甲酯-水为1∶1的两相溶剂体系,1.0 mL/min的洗脱速率从苹果中分离原花青素,对各组分进行飞行时间质谱分析,发现原花青素按聚合度进行分离,聚合度在5～13的原花青素含量最多,其次是原花青素单体,包括(+)儿茶素和(-)表儿茶素。Esatbeyoglu等[57]利用高速逆流色谱(HSCCC)成功从野樱桃中分离出半合成反应混合物,并发现HSCCC可在制备规模上分离纯原花青素B1[(-)-表儿茶素-4β→8-(+)-儿茶素]、B2[(-)-表儿茶素-4β→8-(-)-表儿茶素]、B5[(-)-表儿茶素-4β→6-(-)-表儿茶素]和B7[(-)-表儿茶素-4β→6-(+)-儿茶素]。Esatbeyoglu等[58]首次报道了利用高速逆流色谱法与其他逆流色谱法相结合的方式从可可豆中分离并半合成二聚到五聚的原花青素。Zhang等[59]报道在优化的HSCCC条件下,葡萄籽原花青素可被分离为7个不同的组分,平均聚合度范围为1.5～6.9,且原花青素抗氧化活性与DP值呈负相关。Li等[60]用高速逆流色谱法对可可豆中原花青素进行分级,馏分中原花青素聚合度范围为1～5,二聚原花青素B2纯度超过86%。通过抗氧化活性测定,发现原花青素的抗氧化活性随着其聚合度的增加而降低。Peng等[61]通过实验也发现,与以往方法相比,HSCCC在制备二聚原花青素方面具有一定的优势。Luo等[62]采用HSCCC和prep-HPLC对葡萄籽亚硫酸降解产物进行分级,共获得10种二聚和三聚原花青素,其纯度和产率均较高。Bai等[63]采用高速逆流色谱法从葡萄籽高聚原花青素半合成产物中分离出三个馏分,并使用制备型HPLC分离出各个原花青素,获得了13种B型原花青素,包括单体、二聚体和三聚体,其纯度超过91%。

Kumar等[64]以新鲜茶树叶片为原料,经Sephadex LH-20层析和高速逆流层析得到含有四聚A型和B型原花青素组分。高速逆流色谱法应用相对较多,其分级原花青素制得的产物纯度和产率都较高,但其解吸率低,作为一种相对较新的分离纯化技术,仍有许多理论和实践问题需要解决,另外,尚缺乏完善的设备条件,制备规模受到限制,不适合大规模生产。

2.2 渐进溶剂沉淀法

渐进溶剂沉淀法是指非极性的低分子烷烃溶剂对减压渣油中的各组分具有不同的溶解度,利用溶解度的差异可以实现组分分离。Yang等[17]用渐进溶剂沉淀从芒果果皮中制备寡聚原花青素,并对其进行分馏。研究结果发现渐进溶剂沉淀法可以直接纯化聚合度值接近1的寡聚物。赵丹等[65]以葡萄皮原花青素为原料,采用渐进溶剂沉淀法对其进行分级处理,通过测定后发现随着聚合度的增加,其抗氧化能力下降。渐进溶剂沉淀法分级效果好,且不存在吸附损失,但操作复杂,应用较少。

3 结论

原花青素的生理活性与其聚合度、羟基的数量及位置、单体的连接方式和空间构型等息息相关,分离和制备不同聚合度的原花青素一直以来是研究的热点[66]。总结之前的研究可以发现:

许多不同的分离方法已被用于原花青素的分级,每种分离方法各有优劣。

相比于高聚合度的原花青素,低聚原花青素的分级制备更受关注。这可能是因为植物体内的原花青素常以高聚形式存在,分级制备高聚原花青素相对简单。更重要的是,高聚原花青素的分子量较大,受空间位阻影响,酚羟基活性受到影响。

目前对原花青素的分级很少采用单一的分离方式,在原花青素的分级中,常见的方法是连续采用多种液-固色谱法,或者是采用液-固色谱法和液-液色谱法相结合的方式[67]。这是因为采用单一的分离方式,分级效果不理想,所得分级产物聚合度不集中,纯度较低。采用多种分离方法相结合的方式能最大程度发挥每一种方法的作用,达到进一步纯化或细分的目的。

在分级制备得到不同聚合度的原花青素之后,有部分文献报道了继续测定不同聚合度原花青素的生理活性,但绝大多数局限于测定不同聚合度原花青素的抗氧化和抗癌活性。一般而言,原花青素聚合度越高,抗氧化活性越低,而抗癌活性随之增强,这可能与原花青素羟基的数量和位置以及空间构型有关。

虽然目前对原花青素进行分级的研究较多,但是鲜有研究报道能够分离制备出具有单一聚合度纯度较高的原花青素,这仍然是目前研究的难点,且原花青素与聚合度的构效关系尚不明确。未来可以从以下方面进行深入研究:

每种分离方法在分级制备不同聚合度的原花青素中各有优劣,综合考虑各种方法,扬长避短,优化分级方式,以期达到最佳分级效果。

制备纯度较高的单一聚合度的原花青素,在此基础上研究原花青素的抗氧化、抗癌、降血压、免疫调节等生理活性与其聚合度的关系,明确原花青素与聚合度的构效关系,以期提高原花青素的利用率。