环状RNAFBXW7在三阴乳腺癌中的表达及其临床意义

黄俊，高关凤，曾艳，唐海林，杨凤姣

（1.邵阳学院 基础医学院，湖南 邵阳 422000；2.中山大学 肿瘤防治中心，广东 广州 510000）

乳腺癌是全世界妇女最常见的恶性肿瘤之一[1]。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一种亚型，不表达HER-2 受体、雌激素受体（ER）及孕激素受体（PR）。临床上采取综合治疗方法，对早期TNBC的治疗可以起到一定的效果，而对于中期或晚期患者则以化学疗法为主[2]。但晚期患者化疗的反应期和总体生存期（OS）都较短，且易产生毒性和耐药性[3-6]。尽管TNBC患者仅占乳腺癌患者的12%～17%[7]，但与其他类型的乳腺癌相比，TNBC是侵袭性和转移性最强的亚型，且由于缺乏有效的治疗靶点而被认为是预后最差的亚型[8-9]。毫无疑问，研发更为有效的分子靶标和新型生物标志物是完善TNBC治疗和监测的当务之急。新标靶的探索及相关机制对治疗TNBC具有重要意义。

最近，环状RNA（circular RNA，circRNA）对癌症进展和复发的复杂影响引起了医学界极大的研究兴趣[10]。circRNA是一类内源单链非编码RNA分子，在人类细胞中广泛分布且种类，可以调节真核生物中的基因表达[11]。circRNA作为一种调控性RNA，可以调控基因转录，调节选择性剪接，抑制miRNA的成熟，促进蛋白质与蛋白质的相互作用以及充当miRNA的海绵[12]。它是一种稳定表达的非编码RNA，circRNA的失调在人类癌症发病机理中也起着至关重要的作用[13]。越来越多的报道表明circRNA与多种人类肿瘤相关，例如乳腺癌[14]，肺癌[15]，肝细胞癌[16]，膀胱癌[17]，肾细胞癌[18]和乳腺癌[19]。有研究报道，来自F-box和WD重复结构域的circRNA（circFBXW7）通过编码新型21 kDa蛋白FBXW7-185aa在人脑中的发挥肿瘤抑制因子的作用。基因FBXW7部分外显子来源的circRNA编码的蛋白可与FBXW7 mRNA编码的蛋白协同作用，调控原癌基因Myc的稳定性，从而抑制胶质瘤的发生和进展[20]。最近，一项研究认为circFBXW7可通过竞争性吸附miR-197-3p并编码FBXW7-185aa蛋白上调FBXW7基因表达，从而抑制乳腺癌的进展[21]。然而，circFBXW7在TNBC的作用及机制仍不清楚。本研究旨在探讨circFBXW7对TNBC细胞的增殖、侵袭性的影响。

1 材料与方法

1.1 临床标本与资料

临床标本收集了从2005年3月3日—2011年9月26日于中山大学肿瘤防治中心被确认为TNBC患者的240例新鲜肿瘤样本，患者的随访时间5年以上或者截止到死亡结局发生时。所有切除的组织均立即浸入RNAlater（Ambion，TX）中；患者定期随访，并记录临床数据。这项研究经中山大学肿瘤防治中心伦理委员会批准，并根据赫尔辛基宣言进行。参与本研究前已获得所有患者书面知情同意。240例患者的基本临床资料见表1。

表1 240 例患者的基本临床资料[n（%）]Table 1 The general data of the 240 patients[n(%)]

1.2 细胞株及主要试剂

人类TNBC细胞株MDA-MB-231、HCC1806购自美国ATCC细胞库，经过适当培养并传代不超过10代。MDA-MB231和HCC1806细胞系均无支原体及其他污染物感染。RPMI1640和DMEM（4.5 g）培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司，转染试剂Lipofectamine 2000，TRIzol购自美国Invitrogen公司，SYBRSuper Mix试剂购自日本Takara，PCR引物购自GeneCopoeia有限公司。CCK-8试剂盒购自日本Dojindo，Transwell小室（孔径3.0 μm）购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司。circFBXW7 shRNA购自GeneCopoeia有限公司。

1.3 qRT-PCR 法检测circFBXW7 在TNBC 组织中的表达

乳腺癌组织和细胞用按照试剂说明书用TRIzol裂解提取总RNA，按照GeneCopoeia反转录试剂盒说明书制备cDNA，用SYBRPremix Ex Taq进行qRT-PCR。以GAPDH为内参。利用各实验组目的基因及内参基因的Ct值，按照公式ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，所有qRT-PCR分析均使用Bio-Rad IQTM5多色实时荧光定量PCR检测系统（美国）进行。反应体系为20 µL，每个样本重复3次。

1.4 载体构建和转染

载体的合成和转染人circ FBXW7 的全长cDNA，并将其克隆到pCDNA3.0 载体中以构建过表达质粒，通过q RT-PCR 评估效率，用Lipofectamine 2000进行转染，完全培养基中细胞生长至约50%密度；室温下孵育20 min，使形成脂质体复合体；往复合体中加入无血清的培养液，温和混匀，加入到待转染的培养瓶中；细胞培养箱孵育24～48 h后，收集细胞，抽提总RNA，蛋白。microRNA抑制剂和模拟物由GeneCopoeia公司合成。

1.5 CCK-8 检测细胞增殖

制备单细胞悬液：取对数增殖期的MDAMB-231和HCC1806以103细胞/孔的密度接种在96孔板中，每孔设置3个复孔，孵育48 h后。每个孔中加入10 µLCCK-8溶液添加至铺板的细胞中，将其在37 ℃，5%CO2的潮湿环境中培养，孵育2 h。使用微量滴定板读数器评估450 nm波长的吸光度。

1.6 Transwell 小室检测细胞迁移与侵袭能力

通常，使用迁移室进行Transwell分析，收集稳定转染的细胞，以2×104个悬浮细胞重悬于无血清的培养基中，每孔设置3个复孔，然后转移到水合基质胶室中。并将20%胎牛血清作为趋化剂添加到下室中在37 ℃和5%CO2孵育48 h后，用棉签刮擦上表面的细胞，将膜底部的浸润细胞在室温下用甲醇固定30 min，然后在室温下用结晶紫染色，计数并成像。

1.7 克隆形成实验

消化重悬细胞至适宜密度，以1×103个细胞每孔的数量接种于六孔板中并在温箱中孵育7～14 d，待肉眼可观察到细胞集落形成终止培养。用PBS洗去残余的培养基后，甲醇固定细胞集落10 min，倒去甲醇开盖晾干剩余的甲醇，加入0.1%结晶紫染色15 min。之后，对集落进行拍照和计数。

1.8 统计学处理

本实验数据应用SPSS16.0软件进行统计分析，各组之间的比较采用t检验和χ2检验进行，根据Kaplan-Meier方法绘制OS和无病生存（DFS）曲线，并使用Log-rank检验进行比较，从手术当天起开始计算存活时间。使用Cox回归分析circFBXW7单因素和多因素与生存的关系，以及风险值（HR）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circFBXW7 表达与TNBC 患者预后的关系

240 例TNBC 患者新鲜癌组织标本中circ FBXW7 的平均表达水平为1.043±0.268。以平均表达水平定义为临界值，将患者分为高表达组（表达量>1.043）和低表达组（表达量≤1.043），其中高表达组100例，低表达组140例，低表达组死亡为28 例，复发为30 例；高表达组死亡10例，复发12例。Kaplan-Meier生存分析显示，低circFBXW7组患者的OS和DFS均明显短于高circFBXW7组患者（均P<0.05）（图1）。

图1 不同circFBXW7 表达水平TNBC 患者的OS 和DFS 曲线Figure 1 The OS and DFS curves of TNBC patients with different circFBXW7 expression levels

2.2 TNBC 患者预后因素分析

单因素Cox回归分析显示，组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、circFBXW7表达是TNBC患者预后的影响因素（均P<0.05）；多因素Cox回归分析显示，组织学分级、TNM分期、circFBXW7表达是TNBC患者预后的独立影响因素（均P<0.05）（表2）。

表2 单因素和多因素Cox 回归分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis

2.3 circFBXW7 对TNBC 细胞增殖的影响

为了研究circFBXW7在TNBC细胞中的生物学功能和作用，构建了circFBXW7过表达载体，并验证了其在MDA-MB-231和HCC1806细胞系中的作用，结果显示，过表达组TNBC细胞株（MDAMB-231、HCC1806）的circFBXW7表达量明显高于对照组（均P<0.05）（图2）。细胞增殖测定实验结果表明，circFBXW7的过表达的TNBC细胞系（MDA-MB-231和HCC1806）的增殖能力明显降低（均P<0.05）（图3）。

图2 circFBXW7 在TNBC 细胞株中过表达验证Figure 2 Verification of circFBXW7 over-expression of in TNBC cell lines

图3 过表达circFBXW7 对TNBC 细胞增殖能力的影响Figure 3 Effect of circFBXW7 over-expression on proliferation of TNBC cells

2.4 circFBXW7 对TNBC 细胞的迁移、侵袭的影响

Transwell实验结果显示，circFBXW7的过表达明显抑制了这两种TNBC细胞系的迁移能力（均P<0.05）（图4），加入基质胶后检测过表达circFBXW7后两种TNBC细胞系的侵袭能力（均P<0.05）（图5）。

图4 过表达circFBXW7 对TNBC 细胞迁移能力的影响Figure 4 Effect of circFBXW7 over-expression on migration ability of TNBC cells

图5 过表达circFBXW7 对TNBC 细胞侵袭能力的影响Figure 5 Effect of circFBXW7 over-expression on invasion ability of TNBC cells

2.5 过表达circFBXW7 对miR-197-3p 表达的影响

q RT-PCR 结果显示，过表达组TNBC 细胞（MDA-MB-231、HCC1806）中的miR-197-3p表达量明显低于对照组（均P<0.05）（图6）。

图6 过表达circFBXW7 对miR-197-3p 表达的影响Figure 6 Influence of circFBXW7 overexpression on miRNA-197-3p expression

2.6 抑制miR-197-3p 对circFBXW7 敲除所致的细胞增殖和侵袭能力增强的影响

在敲除circ FBXW7 的细胞中转染miR-197-3p抑制剂，再进行Transwell实验和克隆形成实验，结果显示，抑制miR-197-3 p 后可减少由于circ FBXW7 敲低所致的细胞增殖和侵袭能力的增强（均P<0.05）（图7）。该结果提示，circFBXW7可能是通过miR-197-3p发挥作用，通过吸附miR-197-3 p，减少其表达，抑制肿瘤的发展。

图7 抑制miR-197-3p 对circFBXW7 敲除所致的细胞增殖和侵袭能力增强的影响 A：克隆形成实验检测增殖能力；B：Transwell 实验检测侵袭能力Figure 7 Influences of miR-197-3p inhibition on the increased proliferation and invasion abilities induced by circFBXW7 knockdown A:Colony formation assay for determining proliferation ability;B:Transwell assay for determining invasion ability

3 讨论

尽管诊断和治疗手段得到了一定的发展，但是乳腺癌仍然是女性人群癌症中死亡的主要原因[22]。circRNA是人类癌症中重要的调节因子[23]。随着下一代测序和生物信息技术的迅速发展，人们已经阐明了circRNA在人类癌症中起着至关重要的作用，并表现出作为生物标志物和治疗靶标的巨大潜力[24-26]。circRNA与传统的线性RNA相比，通过反向剪接产生的共价闭合环没有5'-cap或3'-poly（A）尾巴，属于内源性非编码RNA的新兴亚组。其特征是组织特异性和结构稳定性[27-30]。迄今为止，已有不同研究小组筛选和鉴定了多种与癌症（包括乳腺癌在内）相关的功能性circRNA[31]。这些circRNA在多种癌症中起癌基因或抑癌作用[32]。据报道[21,33]circFBXW7具有抑癌作用，在正常脑组织中大量表达，在神经胶质瘤中下调[20]。但是，TNBC中circFBXW7的生物学功能和作用仍然不清楚。本研究探讨了circFBXW7在TNBC中的作用机制及临床价值，使用Kaplan-Meier方法分析了240例TNBC患者的circFBXW7表达水平来评判OS和DFS。结果发现低circFBXW7水平的乳腺癌患者的OS和DFS较差。且Cox分析结果显示，高表达circFBXW7患者死亡的风险明显升高。这些结果表明circFBXW7的低表达与TNBC患者较差的临床预后密切相关。由此可以推断circFBXW7可能是TNBC患者的独立预后因素。

笔者在之前的研究中检测了TNBC 细胞系（MDA-MB-231 和HCC1806）中circ FBXW7的表达水平，其表达水平较低，通过过表达circFBXW7后，用CCK8法检测MDA-MB-231和HCC1806细胞增殖情况并使用Transwell小室法实验检测细胞的迁移能力。结果发现在体外试验中，过表达MDA-MB-231 和HCC1806 细胞中circFBXW7水平后，显著抑制了MDA-MB-231和HCC1806细胞的增殖、侵袭能力，同时，两种细胞的miR-197-3p表达水平也明显降低。然而，使用miR-197-3p抑制剂后，circFBXW7表达降低所致的细胞增殖和侵袭能力增强被明显抑制。以上结果提示，circFBXW7可能通过吸附miR-197-3p，减少其表达，抑制肿瘤的发展。

总之。本研究表明，circ FBXW7 可以抑制TNBC 的发生发展，其作用机制可能与通过miRNA海绵作用吸附miR-197-3p的作用有关，circFBXW7有望成为TNBC预后生物标志物及潜在治疗靶标。