Orexin-A通过激活OX1R、OX2R和非Ca2+依赖的PKC抑制新生大鼠脊髓腹角神经元的γ-氨基丁酸电流

杨鑫宇 ,朱苏月 ,靳 娜 ,李 妍 ,甄 骋 ,张环环 ,徐爱萍,汪萌芽,郑 超

皖南医学院生理科学研究所1神经生物学研究室,2心理生理学研究室,3细胞电生理研究室,安徽 芜湖241002

食欲素(Orexin)是由外侧下丘脑神经元分泌的一种神经活性肽,经过前食欲素原(PPO)酶解和不同蛋白修饰后形成食欲素A(orexin-A)和食欲素B(orexin-B)［1］,通过结合并激活两类特异性G蛋白偶联受体orexin-1型受体(OX1R)和orexin-2型受体(OX2R)参与多种生理功能的调节［1-2］。Orexin神经纤维贯穿整个中枢神经系统,脊髓全长均接受食欲素纤维投射［3］,并表达和分布大量的食欲素受体(OXR)［4-5］。食欲素对脊髓运动控制有直接影响,可提高脊髓运动神经元的放电频率,增强运动神经元的活性和敏感性［6］。γ-氨基丁酸(GABA)能系统在机体运动调控中也发挥重要作用,在脊髓运动神经元存在高亲和力的促离子型GABA受体,通过调节运动神经元的兴奋性参与机体运动控制［7］。食欲素系统对机体功能,如运动控制和睡眠与觉醒等的调控与GABA能等系统之间的交互作用［8-9］密不可分。此外,有报道显示,在OX1R 和GABAA受体转染的HEK293细胞中,orexin-A可以通过GABAA受体β1亚基磷酸化抑制GABAA受体,从而减弱GABA 诱导的超极化电流［10］。但最新研究报道,orexin-A可增强大脑皮质锥体神经元上GABA诱发的抑制性突触后电流［11］。因此,食欲素系统与GABA能系统之间的交互作用存在多样性。而食欲素能否通过调控脊髓腹角神经元的促离子型GABA受体,从而调制脊髓的运动控制功能尚不明确。为深入研究食欲素系统与GABA能系统的交互作用在脊髓运动控制中扮演的角色,本研究选取7～12 d的新生大鼠,对急性分离的脊髓腹角神经元应用单细胞膜片钳记录技术并结合药理学方法,分析orexin-A对脊髓腹角神经元的促离子型GABA受体功能的调制及其机制。这将进一步深化对脊髓运动控制机制的认识,并可为临床上脊髓相关运动疾病的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用7～12 d的清洁级新生SD乳大鼠28只,雌雄不限,母鼠乳喂养,由江苏省南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。动物许可证号码SCXK(苏):2017-0001。动物使用遵循皖南医学院实验室动物饲养和使用规章条例。

1.2 溶液与药品

参照本实验室前期配液操作［12］,配制人工脑脊液(ACSF),配方(mmol/L):124.0 NaCl、24.0 NaHCO3、5.0KCl、1.2 KH2PO4、2.4 CaCl2、1.3 MgSO4、10.0 Glucose,通入混合氧(95%O2+5%CO2)使溶液pH值至7.35～7.45；标准细胞外液配方(mmol/L):10.0 glucose、10.0 HEPES、150.0 NaCl、5.0 KCl、1.0 MgCl2、2.0 CaCl2,Tris-base 调节pH 值至7.4；电极内液配方(mmol/L):0.5 EGTA、120.0 K-gluconate、20.0 KCl、2.0 MgCl2、20.0 HEPES、2.0 Na2-ATP、0.5 Na-GTP,用KOH 调节pH至7.26；膜片钳穿孔药Amphotericin B(AB)配置:母液浓度40 mg/mL(溶于二甲基亚砜DMSO),使用浓度200 μg/mL(溶于电极内液)。实验药品母液的配置,除AB、SB334867、TCSOX229、Bisindolylmaleimide IV(Bis-IV)、Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)用DMSO 溶解外,其余药品母液皆用超纯水(Purelab Flex,ELGA LabWater,UK)配制,并置于-20℃保存备用。Bis-IV、Rp-cAMP和BAPTA不可通透细胞膜,使用时通过溶于电极内液实现细胞内给药。当细胞破膜形成全细胞记录模式后,电极内的工具药可迅速进入细胞内发挥作用。该研究所应用的工具药,如:SB334867、TCSOX229和BAPTA等使用的药物浓度皆是参考已有文献［11,13-16］,并且本研究也做了相应的补充实验,研究不同浓度梯度的SB334867、TCSOX229和BAPTA 所发挥的效应,结果表明SB334867 和TCSOX229浓度选择10µmol/L、BAPTA应用10mmol/L皆已能完全发挥作用。GABA、HEPES、Tris-base、Kgluconate、EGTA、Na2-ATP、Na-GTP、Bis-IV、PMA、RpcAMP 和BAPTA(SIGMA)；AB、orexin-A、SB334867和TCSOX229(Tocris Bioscience)；其他普通试剂(国药集团)。

1.3 脊髓切片的制备

将新生SD大鼠应用乙醚辅助冰浴麻醉后,俯卧位固定在自制手术台上,剪开背部皮肤暴露脊柱,剪开椎管,游离出含腰骶膨大节段的脊髓,修剪神经根和被膜,借助琼脂块将脊髓固定于震荡切片机(Vibratome,Technical Products International Inc,USA)的浴碟中央,切取400～500µm厚度的切片4～5片,置于室温ACSF中孵育30～40 min。从游离脊髓至切片结束要求在15 min内完成,全程通入混合氧气,且在冰水混合物状态下的ACSF中进行脊髓切片制备。

1.4 酶消化过程

孵育完成后将脊髓切片置于含木瓜蛋白酶(Papain,0.18 g/30 mLACSF)的烧杯中,在恒温水浴锅(33 ℃)中持续消化20～26 min,再将切片转移至常温ACSF中孵育40～60 min以终止酶消化,并持续通入混合氧；体视显微镜下,沿脊髓中央管对半切并保留腹角,再将腹角组织转移至盛有氧饱和的标准细胞外液的培养皿(35mm×10mm,Corning,NY,USA)中,使用抛光过的不同口径的巴斯德吸管依次吹打腹角组织,使其松散分离出单个细胞,静置10 min,待腹角神经元贴壁后用于膜片钳记录。

1.5 膜片钳记录

将含脊髓腹角分离细胞的培养皿置于荧光倒置显微镜(Leica DMI 3000B,Germany)下,选取胞体较大、立体透亮、突起多而完整的健康神经元,移至视野中央,低倍镜下放置给药管,使冲洗管管口对准胞体,将玻璃微电极毛坯(Sutter Instrument,Inc.,USA)用微电极拉制仪(Model PC-10 Puller,NARISHIGE,Japan)拉制成记录电极,胞外给药时应用穿孔膜片钳记录模式,记录电极内注入含有穿孔药AB的电极内液,固定于微操纵仪(MP-225,Sutter Instrument,Inc.,USA)的电极夹持器,操控微操纵仪使电极尖端入液,入液后电极电阻若为5～10 MΩ,适用于记录。补偿失调电位,显微镜下缓慢移动电极尖端使其接触细胞,给予负压后使电极阻值达到GΩ形成高阻封接,穿孔药作用下,细胞自动破膜,在电压钳记录模式下,设置神经元基础钳制电位(VH)为-70 mV,当接入电阻(Ra)值<60 MΩ时可对神经元进行给药记录。胞内给药的实验在全细胞膜片钳记录模式下进行,记录电极的内液不含穿孔药,当记录电极与细胞的封接电阻达到GΩ后,利用生物电放大器(MultiClamp 700B,Axon Instrument,Inc.,USA)的Zap联合负压形成全细胞记录,Ra<20 MΩ。

1.6 给药系统及方式

本研究应用快速灌流给药系统(SF-77B Perfusion Fast-step,Warner Instrument Corporation,USA)进行实验。给药采用3秒冲洗-2秒给药-3秒冲洗模式,在重力作用下将药物灌流至记录的神经元。应用GABA受体激动剂γ-氨基丁酸记录在钳制神经元诱发的电流,研究orexin-A对GABA电流的调制作用,并给予OX1R选择性拮抗剂SB334867、OX2R 选择性拮抗剂TCSOX229和PKC 激动剂与阻断剂等药物分析orexin-A 调制GABA电流的作用机制。

1.7 数据采集与分析

本实验记录的电信号经放大器和数模转换器(Digidata 1550A,Axon Instrument,Inc.,USA)录入计算机,应用图像采集软件(LAS V3.8,Leica,Germany)拍摄脊髓腹角分离神经元的形态,用Clampex 10.6软件记录保存数据,运用Clampfit 10.6、Prism 软件(GraphPad Software,USA)和SPSS 18.0软件进行数据统计分析和制图,本实验数据均使用均数±标准差表示。统计方法为配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 急性分离的大鼠脊髓腹角神经元的形态观察

在倒置显微镜下,分离的脊髓腹角神经元状态良好,胞体较大且形态多样,表面光亮,立体感较强,伴多条细长的突起从极端发出,分支多而完整(图1)。

图1 显微镜下脊髓腹角神经元的形态Fig.1 Morphology of the neurons isolated from the spinal cord ventral horn.A:A neuron with a fusiform cell body;B:A neuron with triangular cell body and multiple intact branches.C,D:A quadrilateral neuron with 4 protrusions from the extreme and cell clamped by a glass microelectrode.

2.2 Orexin-A压抑脊髓腹角神经元的GABA电流

在49 例脊髓腹角神经元单独应用100 nmol/L orexin-A［13］不能诱发电流,但orexin-A预处理2 min后,可显著压抑0.3 mmol/L GABA［17-18］诱发的电流(P<0.001),抑制率为(67.48±12.50)%(图2)。在另外11例细胞中,orexin-A对4例细胞的GABA电流有增大作用(P=0.02),对剩余的7例神经元的GABA电流基本无影响(P=0.12)。

图2 Orexin-A对脊髓腹角神经元GABA电流的作用Fig.2 Effect of orexin-A on GABA currents in the ventral horn neurons of the spinal cord(VH=-70 mV).A:GABA alone induces current,while orexin-A alone does not induce current;B:Typical recordings showing that GABA current is reversibly suppressed by orexin-A;C:Statistical results of the effect of orexin-Aon the magnitude of GABAcurrents.n=49,***P<0.001.

2.3 Orexin-A压抑脊髓腹角神经元的GABA电流的作用机制

2.3.1 OXR 介导orexin-A 对脊髓腹角神经元GABA电流的压抑作用 在6例脊髓腹角神经元,联合应用10µmol/L OX1R选择性拮抗剂SB334867和10µmol/L OX2R选择性拮抗剂TCSOX229预处理2 min后,可完全取消orexin-A 对GABA 电流的抑制作用(P=0.93,图3)。

图3 OX1R和OX2R选择性拮抗剂(SB334867和TCSOX229)联合应用对orexin-A抑制GABA电流的影响Fig.3 Effect of the combination of OX1R and OX2R selective antagonists(SB334867 and TCSOX229,respectively)on orexin-A-induced inhibition of GABA currents.A:(a)GABA induces current;(b)Orexin-A inhibits GABA current;(c)GABA current is recovered after washing with standard extracellular fluid;(d) GABA current after application of SB334867 and TCSOX229;(e) Simultaneous application of orexin-A,SB334867 and TCSOX229 causes no significant change in GABA current;(f) GABA current after washing with extracellular fluid containing SB334867 and TCSOX229.B:Bar charts showing the effects of SB334867,TCSOX229 and orexin-A on the amplitude of the GABAcurrents.n=6,*P<0.05,**P<0.01.

2.3.2 OX1R 部分介导orexin-A 对脊髓腹角神经元GABA电流的抑制作用 8个神经元的统计结果显示,给予10µmol/L SB334867后可以部分解除orexin-A对GABA 电流的压抑效应,抑制率下降为(29.21±19.09)%,与经SB334867预处理的GABA电流比较,差异有统计学意义(P=0.001,图4)。

图4 OX1R选择性拮抗剂SB334867对orexin-A抑制GABA电流的影响Fig.4 Effect of OX1R selective antagonist (SB334867) on orexin-A-induced inhibition of GABA currents.A:(a) GABA-induced current;(b)GABA current is inhibited by pretreatment with orexin-A for 2 min;(c)GABA current is recovered after washing with standard extracellular fluid;(d)Application of SB334867 does not affect the amplitude of the GABA current;(e)SB334867 partially relieves orexin-A-induced suppression of the amplitude of GABA current;(f)GABA current differs after washing with standard extracellular fluid containing SB334867 from the pattern in(e).B:Bar charts showing the effects of SB334867 and orexin-A on the amplitude of the GABAcurrents.n=8,*P<0.05,**P<0.01.

2.3.3 OX2R部分参与orexin-A对脊髓腹角神经元GABA电流的抑制效应 在8个分离神经元,给予10µmol/L TCSOX229也能部分取消orexin-A对GABA电流的抑制效应,抑制率下降至(26.59±12.61)%,与TCSOX229预处理后的GABA电流比较,差异有统计学意义(P=0.02,图5)。

图5 OX2R选择性拮抗剂TCSOX229对orexin-A抑制GABA电流的影响Fig.5 Effect of OX2R selective antagonist(TCSOX229)on orexin-A-induced inhibition of the amplitude of GABA currents.A:(a)The current induced by GABA;(b) The inhibition on GABA current by orexin-A;(c) The recovery of GABA current after washing with standard extracellular fluid;(d)GABA current after pretreatment with TCSOX229;(e)TCSOX229 also partially relieves the inhibitory effect of orexin-A on GABA currents;(f)GABA current after washing with standard extracellular fluid containing TCSOX229.B:Bar charts summarizing the effects of TCSOX229 and orexin-A on the amplitude of the GABA currents.n=8,*P<0.05,＊＊P<0.01.

2.3.4 PKC参与orexin-A对脊髓腹角神经元GABA电流的抑制效应,而PKA不参与 Orexin-A结合OX1R和OX2R后可以激活一系列下游信号通路。本实验电极内液加入10µmol/L Bis-IV 后可完全取消orexin-A 对GABA 电流的压抑作用(P=0.31)；同时通过胞外给予PKC激动剂(PMA)验证了上述现象,在6个神经元上使用PMA(1µmol/L)预处理2 min后GABA电流减小,与orexin-A给药后相比,差异无统计学意义(P=0.45)。并且,同时给予orexin-A和PMA不能进一步压抑GABA电流(P=0.15,图6)。然而,当胞内应用PKA抑制剂RpcAMP(50µmol/L)后不能影响orexin-A对GABA电流的抑制作用(P=0.001,图7)。

图6 PKC介导orexin-A抑制脊髓腹角神经元上GABA电流的作用Fig.6 The inhibitory effect of orexin-A on GABA currents is mediated by PKC.A:The suppressive effect of orexin-A on GABA currents is completely nullified by intracellular application of Bis-IV.B:Bar charts summarizing the effect of Bis-IV on the inhibition of the GABA currents by orexin-A(n=5).C:Extracellular application of PMA mimics the suppressive effect of orexin-A on GABA current.D:Bar charts showing the effect of PMAon the suppression of the GABAcurrents by orexin-A.n=6,*P<0.05,**P<0.01.

图7 PKA不参与orexin-A对GABA电流的抑制作用Fig.7 PKA is not involved in orexin-A-induced inhibitory effect of GABA currents.A:PKA inhibitor Rp-cAMP does not affect orexin-A-induced suppression of GABA currents.B:Bar charts showing the effect of Rp-cAMP on the inhibition of the GABA currents by orexin-A.n=5,**P<0.01.

2.3.5 Ca2+不参与orexin-A 压抑脊髓腹角神经元的GABA电流 PKC的激活涉及一系列复杂的反应过程,有研究报道,它的激活可以为Ca2+依赖性［10-11］或非Ca2+依赖性［13,19］,故本实验对细胞内外的Ca2+是否参与介导orexin-A压抑脊髓腹角神经元的GABA电流进行了研究。结果显示orexin-A 在无Ca2+的细胞外液中对GABA电流依然具有显著的压抑作用(P=0.004,n=8,图8),抑制率为(65.97±18.29)%；当胞内应用Ca2+螯合剂BAPTA(10 mmol/L)并不影响orexin-A对GABA电流的压抑作用,抑制率仍为(67.29±11.35)%(n=7,P=0.04,图8)。

图8 Ca2+对orexin-A压抑脊髓腹角神经元GABA电流的影响Fig.8 Effect of Ca2+on orexin-A-induced inhibition on the amplitude of the GABA currents.A:Extracellular concentration of Ca2+does not affect the inhibitory effect of orexin-A on GABA currents.B:Bar charts showing the effect of orexin-A on the GABA currents of the spinal ventral horn neurons in Ca2+-free extracellular fluid(n=8,**P<0.01).C:Intracellular Ca2+does not affect the inhibitory effect of orexin-A on GABA currents.D:Bar charts showing the effect of the intracellular application of BAPTA on orexin-A-induced inhibition of GABAcurrents.n=7,*P<0.05.

3 讨论

脊髓是躯体运动调节的初级中枢,它的神经元网络存在复杂的GABA能系统,在脊髓运动控制中担当重要的调控角色。脊髓运动神经元分布于脊髓腹角中,食欲素可对脊髓运动神经元产生实质性影响［20］。研究显示,orexin-A可对GABA受体产生调控效应,体外脑切片观察到orexin-A显著增加大鼠疑核(NA)心脏迷走神经元上GABAA受体介导的抑制性突触后电流的幅度［21］。然而,orexin-A也可通过抑制GABAA受体,从而降低GABA诱导的超极化电流［10］。已知orexin为一类兴奋性的脑神经肽,许多研究证实其具备增强神经元兴奋性的能力,对中枢神经系统不同部位的神经元产生兴奋作用［22-24］,本研究提示orexin-A可能通过下调脊髓腹角神经元促离子型GABA受体的功能,因而增强了神经元的兴奋性。据报道,orexin-A通过结合并激活与其关系密切的两类G蛋白偶联受体,即OX1R和OX2R而发挥重要的生物学功能［1］,本研究发现orexin-A对急性分离的脊髓腹角神经元的GABA电流具有压抑作用,为进一步分析其作用的受体机制,应用OX1R选择性拮抗剂(SB334867)和OX2R选择性拮抗剂(TCSOX229)共同作用于脊髓腹角神经元上,结果显示两种受体阻断剂联用后,orexin-A对GABA电流的压抑作用被完全取消,单独应用SB334867或TCSOX229,只能部分取消orexin-A对GABA电流的作用,提示orexin-A通过结合脊髓腹角神经元的OX1R和OX2R而抑制GABA电流。Orexin-A与其受体结合后引发一系列胞内信号转导反应,最终引起靶受体构象变化［25］而改变其功能。本研究也对orexin-A与OXR结合后的下游信号转导机制进行了探索,发现PKC 参与了orexin-A 对脊髓腹角神经元GABA电流的压抑作用。已有研究显示,orexin-A与OX1R 和(或)OX2R 的结合均能激活Gq/PLC/PKC/ERK,Gs/AC/cAMP/PKA/ERK(和/或CREB,p38MAPK)以及Gi级联［26］。不同的作用机制可能致使orexin-A 对GABA 受体产生差异性调节,例如,在大脑岛叶皮层锥体神经元上,orexin-A结合OX1R增强GABAA受体介导的抑制性突触后电流,经由IP3/Ca2+/PKC信号通路介导［11］。另外,也有不同结果显示,orexin-A还可通过激活PKC 通路促使GABAA受体β1亚基的Ca2+/CaMKII依赖性磷酸化,从而降低GABA诱导的超极化电流［10］。本研究利用PKC激动剂、阻断剂以及PKA阻断剂观察何种蛋白激酶参与orexin-A对脊髓腹角神经元GABA电流的压抑作用,结果提示orexin-A对促离子型GABA受体的下调效应是通过激活PKC信号通路完成的。PKC的激活可以是Ca2+依赖性的或非Ca2+依赖性的,有研究显示,orexin-B可结合视网膜双极细胞上OX1R和OX2R抑制GABA电流,这种调节效应是通过非Ca2+依赖性的PKC通路完成的［19］。本实验中,当给予无Ca2+细胞外液或胞内应用Ca2+螯合剂BAPTA时,orexin-A对GABA电流的压抑作用不受影响,提示Ca2+不参与该抑制作用。当然,本研究的技术方法也存在一定的局限性,所分离的神经元已不具备突触前成分,近年来有研究证实食欲素能通过突触前机制调节GABA能信号传递,并且食欲素也会影响中枢神经系统神经元中GABA能突触传递［27］,为全面揭示食欲素信号系统对脊髓腹角神经元GABA能突触传递的影响,仍需进一步的深入研究。

大量研究显示急性分离的神经元能保持相对完好的结构和生理特性,细胞膜上保存了主要离子通道的活性［28-30］。此外,已有许多文献报道,通过酶消化结合机械吹打分离单个神经元,并对分离的神经元进行电生理记录和研究［29,31］。在酶消化过程中,本研究选用papain作为蛋白水解酶,相比于其他消化酶有着更好的优势,对神经元的伤害较小,消化切片时间短且作用迅速。如图1所示,本实验分离出的神经元具有典型的形态学特征,保留了原有的电生理特性和生理效应,使得电生理实验结果更加可靠。这些具有良好生理状态的神经元可广泛用于配体门控、电压门控等离子通道的电生理学和药理学研究,已成为研究神经元受体功能和胞内信号转导通路等调控机制的基础。深入了解离子通道活动规律,对探讨中枢神经系统疾病的发生、发展机制具有实质性意义。已有研究证实很多疾病的发生与离子通道的结构改变和功能紊乱有关,即产生了离子通道病,例如:运动功能障碍中的肌萎缩性侧索硬化症是一种神经退行性疾病,其特征在于脊髓、脑干和大脑皮层中运动神经元的选择性变性。曾有研究表明,肌萎缩性侧索硬化症运动神经元中GABAA受体的功能和表达发生了变化,诱导了更高的Cl-流入细胞［32］,因此orexin-A可能成为一种预防和治疗运动神经元疾病的新颖且靶向明确的药物,为运动功能障碍相关疾病和脊髓损伤等治疗提供新的思路。