2,4-二硝基苯肼衍生化共振散射光谱法测定丙二醛*

郑春连，黄胜银，张迎春，罗景鹏，凌绍明

(百色学院化学与环境工程学院，广西 百色 533000)

丙二醛(MDA)是脂质过氧化物代谢产生的一种物质，该物质具有很高的生物活性，能够与DNA、蛋白酶、膜蛋白等结合，产生细胞毒害作用[1]。在研究动植物的生理毒性时，通常以MDA的含量高低作为评价细胞膜系统受损害程度的重要指标[2]。在粮油安全评价中，MDA是衡量食品或油脂脂质过氧化程度的标志物。研究表明，挂面、食用油、肉制品或腌制品中有MDA存在[3-5]，食用MDA含量高的食品会对人体多种器官产生危害。可见，建立一种准确、快速测定MDA方法，对于快速判断食品的品质以及在研究动植物体内细胞膜系统损害程度和药物(或毒物)的药理(毒理)作用有重要的意义。目前，测定MDA的方法主要有高效液相色谱法[6-7]、液相色谱-质谱法[8]、气相色谱-质谱法[9]、分光光度法[10]、荧光法[11]和表面增强拉曼散射光谱法[12]等。色谱法检出限低、灵敏度高，但是检测成本高、操作繁琐；表面增强拉曼光谱法检出限低、灵敏度高，但是SERS基底的稳定性较差，重现性不好；分光光度法操作简单，但灵敏度不高；共振散射光谱法是20世纪90年代发展起来的一种检测速度快、灵敏度高的分析技术，在金属离子、蛋白质、核酸检测上取得较好的效果[13-14]。研究发现，在pH 3.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，丙二醛(MDA)与2,4-二硝基苯肼(DNPH)发生反应生成疏水性的苯腙，导致体系产生共振散射效应，据此建立一种检测MDA含量的共振散射光谱分析方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.0 mg/mL 丙二醛(MDA)储备液：用移液枪移取 231 μL 的1,1,3,3-四甲氧基丙烷溶于适量超纯水，定容于 100 mL 棕色容量瓶中，4 ℃ 冰箱保存备用。25 μg/mL 丙二醛标准工作液：用移液枪移取 2500 μL 1.0 mg/mL 丙二醛储备液于 100 mL 棕色容量瓶，用超纯水定容至刻度。2,4-二硝基苯肼(DNPH)稀乙醇溶液：在 15 mL 浓硫酸中，溶解 3.0 g 2,4-二硝基苯肼，另在 70 mL 95%乙醇中加入 20 mL 水，然后把硫酸苯肼倒入稀乙醇溶液中，混合均匀，如有沉淀过滤备用。不同pH值醋酸-醋酸钠缓冲溶液(BS)：由 0.10 mol/L 醋酸水溶液和 0.10 mol/L 醋酸钠水溶液按一定比例混合而得。

F-7000型荧光分光光度计，日本日立公司；TST-UPB-20型超纯水器，石家庄泰斯特仪器设备有限公司；AE240型电子分析天平，上海梅特勒-托利多有限公司；KG-200KDB型数控超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

在5.0 mL具塞比色管中依次加入pH3.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液 450 μL、适量丙二醛标准工作液、2,4-二硝基苯肼稀乙醇溶液 500 μL，用水定容至 5.0 mL。在 50 ℃ 水浴中加热 40 min，取出流水冷却 3 min。用荧光分光光度计进行同步扫描(EX Slit=EM Slit=5.0 nm，PM Volt=500 V)得共振散射光谱图。计算 438 nm 处的ΔI=I-I0。

2 结果与讨论

2.1 共振散射光谱图

1,1,3,3-四甲氧基丙烷在酸性条件下分解为MDA。由图1可见，缓冲溶液-2,4-二硝基苯肼体系的共振散射强度较弱，当有MDA存在时，MDA与2,4-二硝基苯肼发生化学反应生成疏水性的苯腙，导致体系发生共振散射效应，其中 451 nm、493 nm 处信号较强。实验选择 451 nm 处作为测量波长。

图1 共振散射光谱图

HAc-NaAc缓冲溶液(pH3.8)450 μL，2,4-二硝基苯肼乙醇溶液 500 μL，t=40 min，T=50 ℃。

2.2 检测条件选择

2.2.1 选择缓冲溶液pH值及用量

实验考察不同缓冲溶液pH值(3.2、3.5、3.8、4.4、5.0、5.6)对ΔI的影响。结果发现：缓冲溶液pH值为3.8时，体系的ΔI较大而且稳定，故实验取缓冲溶液pH值为3.8。按照实验方法考察缓冲溶液用量影响。结果显示：随着醋酸-醋酸钠缓冲溶液用量增加，体系的ΔI逐渐加大，当醋酸-醋酸钠缓冲溶液用量为 450 μL 时体系的ΔI较大。实验选择醋酸-醋酸钠缓冲溶液用量为 450 μL。

2.2.2 选择DNPH乙醇溶液用量

实验考察衍生化试剂DNPH乙醇溶液用量影响。结果显示：随着DNPH用量的增加，体系ΔI逐渐增大，当DNPH用量大于 500 μL 时，ΔI随着DNPH用量增加而迅速减少。这可能是增加DNPH用量，体系的空白值增大所致。实验选取DNPH用量为 500 μL。

2.2.3 选择反应时间

实验考察反应时间对ΔI的影响。结果显示：随着反应时间的增加，体系ΔI增大，当反应时间大于 40 min 时，体系的ΔI缓慢减少。实验选取反应时间为 40 min。

2.2.4 选择反应温度

实验考察反应温度对ΔI的影响。结果显示：反应温度对体系的ΔI影响较为显著。反应温度较低时，反应速度慢，体系生成的苯腙微粒数量少，共振散射信号较弱；随着反应温度的增大，反应速度加快，体系生成的苯腙微粒数量增加，共振散射信号强度增强，ΔI逐渐增大；当反应温度为 50 ℃ 时，ΔI达到最大值。反应温度大于 50 ℃ 以后，体系的ΔI逐渐减小，这可能是体系温度较高时副反应增多所致。

2.3 线性回归方程与检出限

移取0、15、50、75、150、200、300、500 μL MDA标准溶液，按照1.2实验方法测定体系的共振散射强度I值，以ΔI为纵坐标，MDA的质量浓度为横坐标，绘制方法的标准工作曲线。方法的线性回归方程为ΔI=68.631+860.13ρ(ρ单位：μg/mL)，线性范围为0.075～2.5 μg/mL，相关系数(R2)为0.9929，检出限(3S/K)为 0.025 μg/mL。

2.4 干扰实验

2.5 样品测定

按照文献[15]的方法对样品进行处理。称取大豆油或猪油各 100 g，加入三氯乙酸-EDTA混合溶液 100 mL(其中，三氯乙酸的质量浓度为 75 g/L，EDTA的质量浓度为 1.0 g/L)，搅拌 30 min，转入分液漏斗进行分离，将提取液转入旋转蒸发器内,在 60 ℃ 左右旋转蒸发至剩余的残留液约为 50 mL 时停止蒸发，冷却，将残留物转移到 100 mL 容量瓶，用超纯水定容至刻度，4～6 ℃ 冰箱保存备用。

取约 10 mL 待测液过 0.45 μm 滤膜，再取适量滤液按照1.2实验方法测定MDA含量并做加标回收实验，结果见表1。

表1 猪油、大豆油中MDA含量及加标实验结果 (n=5)

由表1可见，本法的测定值与UV/VIS法[16](2010)的测定结果相吻合。

3 结论

在pH3.8醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，MDA与DNPH发生亲核加成反应生成疏水性的苯腙而导致体系的共振散射信号增强，其中 451 nm、493 nm 处信号较强(实验取 451 nm 为测定波长)，据此建立了一种共振散射光谱检测MDA含量法，方法的线性回归方程为ΔI=68.631+860.13ρ(ρ单位：μg/mL)，线性范围为0.075～2.5 μg/mL，相关系数(R2)为0.9929，检出限(3S/K)为 0.025 μg/mL。将本法应用于猪油和大豆油中MDA含量测定，测定结果的RSD在2.3%～3.1%，回收率在97.2%～108%。