UPLC 法比较黄芩不同炮制品中5 种黄酮类成分

罗 兰魏劭恒张 英吴孟华曹 晖马志国*

（1.中山大学新华学院药学院，广东 广州510520； 2.暨南大学药学院，广东 广州510632； 3.暨南大学岭南传统中药研究中心，广东 广州510632）

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi.的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效［1］。黄芩临床应用广泛，炮制规格较多，除生品外，酒黄芩和黄芩炭是常用的2 种饮片规格。清热泻火解毒多用生品、清上焦肺热多用酒炙品、清热止血多用炭品［2⁃3］。以黄芩苷为代表的黄酮类是黄芩的主要活性成分［4⁃5］，黄芩不同炮制品黄酮类成分的比较研究虽有研究报道，但主要是采 用HPLC 指纹图 谱［6⁃7］或多成 分定量的方法［8⁃12］，或采用LC⁃MS 法对成分进行定性定量分析［6，13］，且多是生品与酒黄芩或黄芩炭2 种炮制品之间的比较。UPLC 法因具有更高的分离度和更快的分析速度，在黄芩药材中已有应用［14⁃15］，但未见采用UPLC 法对黄芩3 种饮片中5 种黄酮类成分（黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷）进行对比研究的报道。本研究采用UPLC 法比较黄芩生品、酒黄芩、黄芩炭中5 种黄酮类成分的含量变化，以期为黄芩及其炮制品质量评价提供参考，为黄芩炮制原理的阐释提供研究基础。

1 材料

Agilent 1290 超高效液相色谱仪［四元超高压梯度泵、光电二级管阵列检测器（DAD）、自动进样器、柱温箱、Agilent Chemstation 工作站，美国安捷伦公司］；ALC⁃110.4 电子分析天平（万分之一，德国赛多利斯公司）；AX223ZH 电子天平（美国奥豪斯公司）；KQ5200E 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；多功能粉碎机（永康市绿可食品机械有限公司）。

黄芩苷对照品（批号110⁃715⁃201016，中国食品药品检定研究院）；黄芩素（批号H⁃018⁃170426）、汉黄芩苷（批号H⁃019⁃161221）、汉黄芩素（批号H⁃029⁃171216）、野黄芩苷（批号Y⁃012⁃170825）对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈、甲酸（色谱纯，上海晶纯试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯；水为纯净水（华润怡宝食品饮料有限公司）。

黄芩饮片（生品）3 批，分别购自广州二天堂大药房（批号180501541）、广州老百姓大药房（批号180309）、广州林和药业（批号180528），经暨南大学岭南传统中药研究中心马志国教授鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi.干燥根的炮制品。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备

2.1.1 酒黄芩 参照2020 年版《中国药典》 一部黄芩项下的酒黄芩炮制方法，取3 批黄芩饮片生品各约100 g，分别加黄酒10 mL，拌匀，闷透，置炒锅中，用文火炒至深黄色，取出，放凉，备用。

2.1.2 黄芩炭制备 参照2020 年版《中国药典》一部附录“0213 炮制通则”中的炒炭法，取3 批黄芩饮片生品各约100 g，分别置热锅内，用武火炒至黑褐色，喷淋清水少许，熄灭火星，取出，晾干，备用。

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，制成质量浓度 分别为0.110、0.278、0.119、0.125、0.115 mg／mL 的贮备液，分别精密吸取0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 将生黄芩、酒黄芩、黄芩炭饮片分别粉碎过4 号筛，各取约0.3 g，精密称定，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入70% 乙醇40 mL，称定质量，超声处理40 min，取出，放冷，70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL 置10 mL 量瓶中，70%乙醇稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相乙腈（A）⁃0.5%甲酸（B），梯度洗脱（0～20 min，20%～50% A；20～21 min，50%～90%A）；体积流量0.3 mL／min；柱温35 ℃；检测波长280 nm；进样量1 μL。在该色谱条件下，5 种成分理论板数均大于10 000，分离度均大于1.5，色谱图见图1。

图1 各成分UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 取“2.2.1”项下不同质量浓度的对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下分别进样1 μL。以各对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归，结果见表1，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样6 次，每次1 μL，测得野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的峰面积RSD 分别为0.56%、0.69%、0.55%、0.69%、0.64%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下于0、2、4、6、8、12、16 h 进样，每次1 μL，测得野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积RSD分别为0.72%、0.26%、0.29%、0.65%、0.94%，表明供试品溶液在16 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取生品粉末6 份，每份约0.3 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样，测得野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量RSD 分别为 1.23%、1.20%、1.15%、1.15%、1.05%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取“2.7”项下含量已知的生品粉末5 份，每份约0.15 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品溶液各5.0 mL，黄芩苷对照品溶液10 mL，70%乙醇补足至40 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样分析，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝5）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝5）

2.9 样品含量测定 分别取生黄芩、酒黄芩和黄芩炭样品粉末各3 批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样，计算野黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg／g，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various con⁃stituents（mg／g，， n＝3）

表3 各成分含量测定结果（mg／g，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various con⁃stituents（mg／g，， n＝3）

3 讨论

本实验采用DAD 全波长扫描对检测波长进行考察，结果表明5 种成分均在280 nm 处有最大吸收，故选择280 nm 为检测波长。此外，比较了乙腈⁃0.1%甲酸和乙腈⁃0.5%甲酸，发现0.1%甲酸作为流动相时不仅出峰晚，且存在拖尾现象，而0.5%甲酸分离度高，在此基础上，对梯度洗脱程序进行了优化。综合考虑色谱峰的出峰时间、分离度、峰型，最终选择“2.3”项下色谱条件。

本研究结果显示，黄芩生品酒炙后5 种黄酮类成分总量下降了3.9%，其中野黄芩苷、黄芩苷和汉黄芩苷含量分别降低了13.3%、6.5%、12.2%，而黄芩素和汉黄芩素含量分别增加了102.8%、114.2%。与生品相比，黄芩炭中5 种黄酮类成分总量下降了67.8%，其中野黄芩苷含量极低，已无法检测到；黄芩苷和汉黄芩苷含量分别降低了88.9%、89.9%，而黄芩素和汉黄芩素含量分别增加了444.2%、750.0%。黄芩苷与黄芩素、汉黄芩苷与汉黄芩素互为黄酮苷与苷元，表明酒炙、炒炭等加热炮制方法，均会造成黄芩中黄酮类成分总量减少，且黄酮苷类成分会发生部分分解生成相应的苷元，这种变化与炮制程度呈正相关。因酒炙采用文火加热，温度低，对黄酮类成分影响程度较低；而炒炭为武火加热，温度高，黄酮苷类成分大部分被破坏，或分解为苷元，此结果与文献报道的基本一致［8，16⁃18］。此外，图1 中黄芩炭色谱图中16.5 min处出现一新的色谱峰，通过与文献 ［8］ 对比，此成分可能为千层纸素A，其转化生成路径及结构还有待于进一步研究。

本研究结果显示，黄芩炮制后，黄酮类成分的含量与相对比例均发生了明显变化，这与黄芩不同炮制品间功效的差异密切相关。生黄芩，味苦、性寒，所含5 种黄酮类成分总量最高，且以黄芩苷为主，长于清热泻火。黄芩酒炙后，总黄酮含量略有减少，且酒性大热，从而缓和了苦寒之性，用于上焦肺热及四肢肤表之湿热。黄芩炒炭后，总黄酮含量大大降低，苦寒之性大减，但黄芩素、汉黄芩素等苷元含量及在总黄酮中所占比例均明显增加，以清热止血为主，但黄芩炭止血作用是否与黄芩素、汉黄芩素等黄酮苷元有关，尚有待于进一步研究。