灭菌和贮藏温度对荔枝汁中多酚化合物组成、含量及其抗氧化活性的影响

王 丹，王智能,，董丽红，舒 彬,，王俊敏,，苏东晓，吴光旭,4,

（1.长江大学生命科学学院, 湖北荆州434020；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东广州510610；3.广州大学化学化工学院，广东广州510610；4.长江大学荆楚特色食品研发中心，湖北荆州434000）

荔枝是一种热带及亚热带水果，在世界各地都有栽培，特别是在中国、越南、泰国、美国等国种植较多，是世界上许多国家的经济作物[1−2]。已有研究表明荔枝果肉中含有大量的酚类化合物，其中原花青素、没食子儿茶素、表儿茶素含量分别高达89.32、87.09和31.15 mg/g[3]。酚类化合物是植物的次生代谢产物[4−5]，槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷、表儿茶素和芦丁是荔枝果肉中的主要酚类化合物[6−8]。除此之外，酚类物质也是最活跃的抗氧化衍生物，这不仅是它们具有提供氢或电子的能力，还因为它们具有稳定的自由基中间体[9]。荔枝果肉中的酚类化合物具有抗氧化、抗炎和降血脂的作用[10−11]。

荔枝果实是在六月至八月的炎热雨季采摘的，不耐贮藏，易受微生物的影响而腐烂[12]，荔枝果肉可制成荔枝汁，不仅保留荔枝原有香味，而且保质期长，具有市场潜力。热处理在食品工业中得到了广泛的应用，其在酶的灭活和防止微生物繁殖变质方面具有很好的效果[13−14]。经过热处理的水果和蔬菜由于热处理过程中的各种化学变化，其生物活性显著提高，Alongi等[15]报道了生苹果汁经巴氏杀菌后，总酚浓度从5.33 mg/L增加到32.66 mg/L，邓俊琳等[16]研究表明，与冷冻干燥相比，热风干燥处理的余甘子样品多酚化合物含量和总多酚含量更高，抗氧化活性更强。荔枝汁经不同灭菌方式（70 ℃巴氏杀菌或121 ℃高温灭菌）和不同温度贮藏（4 ℃或 45 ℃）后，其酚类特性和抗氧化活性的变化鲜见报道。

本研究的目的是探究不同热处理温度和不同贮藏温度对荔枝汁中酚类物质含量和组成及抗氧化活性的影响，并为荔枝汁加工工艺提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本研究所用荔枝品种为俊红 2018年7月从广州天平架水果批发市场采购所得；没食子酸、没食子儿茶素、香草酸、咖啡酸、表儿茶素、丁香酸、阿魏酸、芦丁 上海源业生物科技有限公司；槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷 实验室自制[6]；铁离子抗氧化能力（Ferric Reducing Ability of Plasma，FRAP）试剂盒 南京建城生物工程研究所；福林酚试剂、荧光素二钠盐（FL）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐（AAPH） 美国Sigma-Aldrich公司；乙酸、乙腈色谱纯，中国赛默飞世尔公司。

TD6型冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；UV-2450型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；HPLC-1260型高效液相色谱仪 美国AgiLent 公司；LS-75HD型立式电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；X5型水浴锅 瑞士SaLvis 公司；Infinite M200pro型酶标仪 奥地利TECAN公司；Ultra Scan VIS型色度仪 美国Hunter Lab公司；gzx-9420 MBE型恒温电热空气干燥器 中国上海Boxun工业有限公司；DW-86L486超低温冰箱 中国海尔公司。

1.2 实验方法

1.2.1 俊红荔枝汁的制备 新鲜荔枝用自来水冲洗，手动去皮和去核，将果肉进行榨汁处理。以4000 r/min离心5 min，取上清液得到荔枝汁样品。每30 mL荔枝汁置于玻璃容器中，分别做如下处理：荔枝原汁作为对照，70 ℃巴氏杀菌即70 ℃热水浴30 min，121 ℃高温灭菌为在121 ℃蒸汽灭菌锅中热处理30 min。然后，将荔枝汁分为两组：一组在低温（4 ℃）下冷藏0、24、72、120和168 h，另一组，按Rao等[17]所报道的加速贮藏，在45 ℃条件下储存0、6、24、48和72 h。所有试验样品在指定时间内取出并分装储存于−80 ℃冰箱中进行下一步分析。

1.2.2 总酚和总黄酮含量的测定 总酚和总黄酮含量测定的方法参照Su等[18]的方法。总酚和总黄酮含量分别以没食子酸和芦丁作为标准，以每百毫升荔枝汁中没食子酸和芦丁含量当量表示。总酚标准曲线回归方程为y=0.0017x+0.0249，决定系数R2=0.9996，总酚含量在40～400 μg/mL范围内线性关系良好。总黄酮标准曲线回归方程为y=0.0011x−0.0007，决定系数R2=0.9997，总黄酮含量在50～500 μg/mL范围内线性关系良好。

1.2.3 FRAP抗氧化能力的测定 FRAP抗氧化能力的测试依据试剂盒上的操作说明进行，以硫酸亚铁作为标品绘制标准曲线，计算各样品的FRAP抗氧化能力值。得到线性回归方程：y=0.255x−0.0083，决定系数R2=0.9999，当FeSO4在所用体系中浓度为0.15～1.5 μmol/L时，与其线性关系良好。

1.2.4 ORAC抗氧化能力的测定 ORAC抗氧化能力的测定参考Su等[6]报道，并稍作修改。荔枝汁用75 mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）稀释备用，黑色96孔板的每个孔中加20 μL荔枝汁或Trolox标准溶液（6.25～50 μL）或标品对照（标品对照为0.11 mg/mL没食子酸）。将96孔板置于酶标仪上孵育10 min后加入200 μL荧光素，再孵育20 min。然后加入20 μL AAPH溶液（119 mmol/L）。荧光测定条件如下：激发波长485 nm，发射波长538 nm，连续测定各孔的荧光强度监测荧光衰退情况，每4.5 min重复一次，测定35个循环。ORAC抗氧化能力值以每百毫升中所含Trolox当量表示。

1.2.5 荔枝汁中单体酚类物质含量及组成的测定根据Zhang[19]的方法稍作修改，采用反相高效液相色谱法对荔枝汁中的酚类化合物进行鉴定。采用YMC-Pack ODS-A柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30 ℃；进样量20 μL；DAD检测器；流动相流速1.0 mL/min下进行高效液相色谱分析。流动相为溶剂A（水/乙酸，996:4）和溶剂B（乙腈）。以下为洗脱梯度：0～40 min溶剂B：5%～25%；40～45 min溶剂B：25%～35%；45～50 min溶剂B：35%～55%；总运行50 min，平衡5 min。

1.3 统计分析

所有试验均平行测定3次，结果以平均值±标准差（M±SD）表示。采用SPSS 19软件进行单因素方差分析，并以SNK检验比较各组间显著性差异，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 热处理和贮藏温度对荔枝汁总酚含量的影响

图1 不同热处理温度和不同贮藏温度对荔枝汁总酚含量的影响Fig.1 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on the total phenolic content of lychee juice

俊红荔枝汁在灭菌处理和贮藏条件下，其总酚含量的变化如图1所示。在0 h，巴氏杀菌和高温灭菌荔枝汁与荔枝原汁相比，其总酚含量分别增加了5.32%和62.02%。高温灭菌荔枝汁的总酚含量与巴氏杀菌的相比增加了53.84%。Alongi等[15]报道，苹果汁经90 ℃处理14.8 min后，总酚含量提高到原苹果汁的6倍。总酚含量的增加可能是由于热处理使多酚氧化酶失活以及不耐热化合物的热诱导水解释放单体和二聚体，酶催化活性被破坏，酚类化合物无法聚合，阻止了酚类化合物参与褐变反应[15,19]；另一方面高温促进植物组织细胞破碎和共价键的断裂，促进更多酚类物质的释放[16]。因此，热处理能促进荔枝汁中酚类物质的释放，且其释放量随热处理温度的升高而增加。荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁在4 ℃条件下贮藏168 h后，其总酚含量显著降低（P<0.05），与徐涓等[20]研究报道未处理的余甘子果汁和经高温处理的余甘子果汁在4 ℃条件下贮藏7 d，总酚含量均显著降低结果一致，酚类物质质量浓度减少可能是其氧化聚合和多酚氧化酶的酶促反应导致；而在45 ℃条件下贮藏72 h后，其总酚含量与它们0 h的总酚含量相比分别增加了37.79%和40.27%，这种差异主要是由于没食子酸含量的增加[18]。高温灭菌荔枝汁中总酚含量的变化与它们不同，4 ℃贮藏期间其总酚含量未见显著降低（P>0.05），这是因为高温蒸汽处理可钝化多酚氧化酶，从而抑制多酚化合物的氧化[20]；而45 ℃贮藏条件下其总酚含量显著降低（P<0.05），与高温灭菌0 h相比降低了18.23%，这与曾庆帅[21]的研究结果一致；高温灭菌荔枝汁45 ℃贮藏条件下其总酚含量降低的原因可能为，高温贮藏过程中，食物基质中发生多种化学反应，而酚类化合物的降解与化学反应的类型有关[22]。因此，4 ℃和45 ℃贮藏温度对于荔枝汁中总酚含量的变化具有显著影响（P<0.05）。

2.2 热处理和贮藏温度对荔枝汁总黄酮含量的影响

图2 不同温度热处理和不同贮藏温度对荔枝汁总黄酮含量的影响Fig.2 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on the total flavonoid content of lychee juice

在热处理过程中，俊红荔枝汁中总黄酮含量的变化与其总酚含量的变化相一致（图2）。经121 ℃高温灭菌后立即测定其总黄酮含量，并与0 h的荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁相比，分别增加了17.36%和16.86%。研究表明，在90 ℃热处理后，果汁-大豆饮料的总黄酮含量增加了61.54%[22]，热处理对酚酸和黄酮物质的释放具有促进作用。但在4 ℃和45 ℃贮藏期间，荔枝汁中总黄酮含量的变化与其总酚含量的变化不一致。荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁中的总黄酮含量在4 ℃和45 ℃贮藏期间均未显著降低（P>0.05）。与Dos等[23]报道，新鲜橙汁经88 ℃热处理后，8 ℃贮藏15 d后，其总黄酮含量未见显著下降结果一致。而高温灭菌荔枝汁中的总黄酮含量在45 ℃贮藏期间，随贮藏时间的延长而显著降低（P<0.05），72 h后降为最低值42.96 mg RE/100 mL，与高温灭菌0 h相比降低了41.32%。研究表明长时间加热可使黄酮含量降低，损失程度取决于化合物的化学结构和孵育时间[24]。该条件下黄酮含量降低原因可能是由于荔枝汁经高温灭菌处理后生成的黄酮类物质，在45 ℃高温贮藏条件下不能稳定存在，该物质易发生降解。因此，结果表明，45 ℃高温贮藏条件对于荔枝汁中总黄酮含量的变化具有显著影响（P<0.05），俊红荔枝汁中的总黄酮含量在4 ℃低温贮藏条件下能稳定存在，不易降解。

2.3 热处理和贮藏温度对荔枝汁中总抗氧化能力的影响

用FRAP法测定了俊红荔枝汁的抗氧化活性（图3），结果表明俊红荔枝汁经121 ℃高温灭菌后其FRAP抗氧化能力与0 h的荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁相比显著增强（P<0.05），其结果与总酚含量测定的结果相一致，这是由于，热处理可能破坏细胞壁，从荔枝汁中不溶性部分释放抗氧化化合物或者释放了结合态酚，可能是加热改变了与酚相结合的蛋白质，导致酚含量的增加，或加热水解单宁分解为小分子的酚，这些反应产物具有不同抗氧化能力[25]。在4 ℃贮藏168 h后，荔枝原汁、巴氏杀菌和高温灭菌荔枝汁中的FRAP抗氧化能力与0 h的荔枝汁相比均降低，这与何礼等[26]研究结果有差异，可能是因为贮藏时间以及原料品种不同，在何礼等的研究中FRAP抗氧化能力随贮藏时间延长波动较大。荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁在45 ℃条件下贮藏72 h后，其抗氧化能力增强，而高温灭菌荔枝汁则显著降低 (P<0.05)，且与荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁中的FRAP抗氧化能力相比无显著性差异（P>0.05）。高温灭菌会增加荔枝汁的抗氧化能力。

图3 不同温度热处理和不同贮藏温度对荔枝汁总抗氧化能力的影响Fig.3 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on the total flavonoid content of lychee juice

2.4 热处理和贮藏温度对荔枝汁中ORAC抗氧化能力的影响

采用ORAC抗氧化法对俊红荔枝汁中抗氧化活性测定的结果如图4所示。俊红荔枝汁经121 ℃高温灭菌后其ORAC抗氧化能力与0 h的荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁相比分别增加了40.24%和39%，这一结果与其总酚含量和FRAP抗氧化能力测定的结果相一致。据报道，在高温灭菌3 min后，绿芦笋汁的抗氧化能力约为新鲜芦笋的1.68倍[27]。在4 ℃贮藏168 h后，荔枝原汁、巴氏杀菌和高温灭菌荔枝汁中的抗氧化能力与0 h的相比均显著降低。在45 ℃条件下贮藏72 h后，荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁中的抗氧化活性与0 h的荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁相比都增加，而高温灭菌荔枝汁则显著降低（P<0.05）。以上结果与FRAP分析结果一致，进一步说明热处理和高温贮藏可以促进酚类物质的释放，提高其抗氧化活性。

图4 不同温度热处理和不同贮藏温度对荔枝汁ORAC的影响Fig.4 Effects of different heat treatments and different storage temperatures on ORAC of different varieties of lychee juice

2.5 热处理和贮藏温度对荔枝汁中酚类化合物的含量及组成的影响

采用HPLC-DAD检测出俊红荔枝汁中含有11种酚类化合物：没食子酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、表儿茶素、没食子儿茶素、槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷、芦丁、原花青素B2和原花青素A2（图5）。根据图5计算出各物质的含量如表1所示。在0 h，巴氏杀菌荔枝汁与荔枝原汁相比，丁香酸、表儿茶素、槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷、原花青素B2的含量增加，阿魏酸和咖啡酸的含量降低，说明酚类化合物之间的转化受热处理的影响[28]。在0 h，高温灭菌荔枝汁中的没食子酸含量与荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁相比显著增加（P<0.05），槲皮素-3-O-云香糖-7-O-鼠李糖苷和阿魏酸的含量则显著降低（P<0.05），除此之外没食子儿茶素被生成，其含量约占121 ℃高温灭菌荔枝汁中总酚类化合物含量的91.74%。没食子儿茶素是儿茶素类化合物中8种单体中的一种，表儿茶素或原花青素均能与没食子酸发生酯化反应生成没食子儿茶素[29]。除此之外，高温灭菌荔枝汁中表儿茶素完全降解。有研究表明灌装和瓶装的茶饮料经120 ℃高压灭菌后，在运输和销售的过程中，饮料中低浓度的表儿茶素会被转化成相应的差向异构体，其中包括没食子儿茶素，而这些差向异构体的含量与表儿茶素相似或更高[30]。因此，表儿茶素的降解可能是没食子儿茶素大量生成的主要原因；此外，121 ℃高温会促进荔枝汁中没食子儿茶素的释放。在4 ℃贮藏168 h后，荔枝汁中总酚含量与0 h相比均降低，这与其总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性的结果相一致。在45 ℃贮藏72 h后，俊红荔枝汁中酚类化合物的含量及其组成发生显著变化，主要表现为其中荔枝原汁和巴氏杀菌荔枝汁中没食子酸含量显著增加（P<0.05），高温灭菌荔枝汁中没食子儿茶素完全降解。没食子儿茶素发生消失，是因为在持续的高温贮藏条件下，热分解导致生物活性化合物的损失[18]。除此之外，荔枝汁为酸性环境，儿茶素类在酸性环境中多不稳定，特别是在高温酸性的环境下，随贮藏时间的延长易发生降解[4]。由表1可知，高温灭菌荔枝汁中均未检出表儿茶素，Lee等[31]研究表明，随着温度和时间的增加，表儿茶素类物质减少，表儿茶素差向异构体增加，高温灭菌荔枝汁均未检出表儿茶素，可能是因为热处理诱导共价结合儿茶素的释放和儿茶素的异构化。

图5 高效液相色谱图Fig.5 High performance liquid chromatography

表1 热处理和贮藏温度对荔枝汁中酚类物质含量及组成的影响Table 1 Effects of heat treatment and storage temperature on content and composition of phenolic in lychee juice

3 结论

热处理和贮藏温度对俊红荔枝汁中酚类特性和抗氧化活性具有显著影响。70 ℃巴氏杀菌和121 ℃高温灭菌均可促进荔枝汁中酚类化合物的释放，121 ℃高温灭菌荔枝之中总酚含量更高。4 ℃低温贮藏，荔枝汁中酚类物质的含量降低，但其酚类物质组成的变化较小。45 ℃高温贮藏，对于荔枝汁中酚类物质的含量及其组成均具有显著影响。因此选取121 ℃作为荔枝汁的灭菌温度，4 ℃作为荔枝汁的短期贮藏温度。本研究提出的荔枝汁的灭菌和贮藏温度能提高荔枝汁中酚类物质的含量及抗氧化活性，为荔枝汁的加工及贮藏提供了较好的理论基础，为生产荔枝汁产品提供便利。