西藏不同海拔牦牛奶渣营养、风味特性及抗氧化活性研究

杨飞艳，罗 章，谢司伟，刘春爱，黄文阳，孙术国,

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙 410004；2.西藏农牧学院食品科学学院，西藏林芝 860000）

牦牛（Bos grunniens）是牛属类比较优秀的品种之一，可以在极端恶劣环境生存，如高海拔（2500～5000 m）、低氧和低温（−40 °C）等[1]。在中国，牦牛乳的经济重要性仅次于奶牛乳和水牛乳，是藏族居民必不可少的饮食[2]。牦牛乳含有多种主要营养成分，如蛋白质、钙、维生素、脂肪、必须氨基酸、乳糖以及微量元素等[3−4]。奶渣是由牦牛全乳提制酥油脱脂，经热处理后，再加入皱胃酶或酸奶进一步过滤、晒干而成，因水分含量低，易于保存[5−6]。牦牛奶渣具有较高含量的蛋白质、氨基酸、钙、铁、维生素、乳糖等营养成分，较低含量脂肪[7−9]，营养丰富，可以直接食用，也可以作为辅料添加到其它食品使用，譬如糌粑、面包等，因而奶渣是藏族人民最喜爱的食品之一，也是藏族人民重要的食物蛋白来源，其市场潜力和发展前景广阔。

然而，由于对奶渣营养、风味品质及其功能缺乏系统研究，特别是不同海拔牦牛奶源的差异，以及不同海拔、不同地区奶渣加工工艺的差异，造成不同海拔奶渣营养、风味品质及其功能也存在显著差异，系统研究西藏不同海拔奶渣营养、风味品质及其功能特性，为奶渣合理利用和产品开发奠定理论基础。基于此，本实验拟以西藏三个不同海拔地区牦牛奶渣样品为研究对象，分析其在营养、风味、热力学特性、流变学特性以及抗氧化活性等功能方面的差异，研究不同海拔对奶渣上述品质的影响程度，以期为全面了解牦牛奶渣提供依据，对开发西藏地区少数民族特色乳制品具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛奶渣 选取西藏三个不同海拔地区的市售牦牛奶渣，将其标记为NA（海拔2500～2800 m奶渣）、NB（海拔3500～4000 m奶渣）、NC（海拔4300 m以上奶渣），为了降低选样所造成的误差，同一海拔奶渣原料购于5个不同的销售点，为了降低系统误差，采用样品分别检测和混合检测相结合，所有结果求平均值，购置的奶渣置于−20 ℃保存备用；无水硫酸铜、硫酸钾（均为分析纯） 天津市瑞金特化学品有限公司；氢氧化钠、三氯化铁、硫酸亚铁、醋酸钠、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团；DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、Tris-HCL（TRIS hydrochloride，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）、邻苯三酚、邻菲罗啉、TPTZ（DLDithiothreitol，二硫代苏糖醇） 美国Sigma公司。

MS105DU分析天平 岛津仪器（苏州）有限公司；RN 4.1哈克流变仪 德国Rheotest公司；DSC 200 F3差示扫描量热仪 德国（耐驰）公司；7890B/7000CGC/MS串联质谱仪 安捷伦科技有限公司；2777C UPLC system高效液相色谱仪 美国Waters公司；L-89000氨基酸分析仪 日本日立公司；SZF-06C脂肪测定仪 上海洪纪仪器设备有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同海拔奶渣热力学特性的测定 精确称取3.0 mg样品，置于铝盒中，压片。DSC牦牛奶渣的行为与温度监控扫描程序设置为以10 ℃/min的速率加热至220 ℃，氮气流速40 mL/min[10]。

1.2.2 不同海拔奶渣黏弹特性的测定 流变学特性参考马晓灵等[11]方法，稍作修改。采用哈克流变仪测定奶渣的黏弹特性，将样品添加至载物台上，探头与载物台之间间隙保留1 mm，进行应变扫描、频率扫描测定。应变扫描程序：采用振荡模式，频率固定为1 Hz，温度为25 ℃，平衡时间为180 s，应变变化范围0.01%～100%。频率扫描程序：采用振荡模式，在应变扫描的基础上确定线性黏弹区并选定一个恒定应变（0.25%），扫描频率0.01～100 Hz，测定样品的储藏模量（G′）和损耗模量（G″）。

1.2.3 不同海拔奶渣主要营养成分的测定 氨基酸含量测定参照GB5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》；粗蛋白的测定参照GB/T5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》；灰分的测定参照GB/T5009.4-2016《食品中灰分的测定》；粗脂肪的测定参照GB/T5009.6-2016《食品中脂肪的测定》；水分的测定参照GB/T5009.3-2016《食品中水分的测定》；VA的测定参照GB/T5009.82-2016《食品中VA的测定》；VE的测定参照GB/T5009.82-2016《食品中VE的测定》；VD3的测定参照GB/T5009.82-2016《食品中VD3的测定》；磷的测定参照GB/T5009.87-2016《食品中磷的测定》；钙的测定参照GB/T5009.268-2016《食品中钙的测定》；铁的测定参照GB/T5009.268-2016《食品中铁的测定》。

1.2.4 不同海拔奶渣风味成分的测定 应用GCMS法测定不同海拔牦牛奶渣中挥发性成分的相对百分含量，并对比分析其挥发成分的差异[12]。

色谱柱：DB-5ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：初始温度40 ℃，以10 ℃/min的速率升至250 ℃，保持2 min；进样口和检测器（MSD）温度：250 ℃；EI，电子能量70 eV，灯丝发射电流200 μA，离子源温度230 ℃，接口温度：250 ℃。以全扫描的方式进行数据采集（载气-氦气（He）；流速−1 mL/min；压力−11.567 psi和吹扫流量−50 mL/min；隔垫吹扫流量−3 mL/min）。

试验数据处理由Xcalibur 软件系统完成，由保留时间计算得到的保留指数（Rentention Index，RI）来对所检测到的化合物进行定性分析，通过各化合物的峰面积归一化进行定量分析计算其相对百分含量。

1.2.5 不同海拔奶渣抗氧化活性的测定

1.2.5.1 奶渣样品液的制备 按奶渣样品:水=1:4（w/v）的比例在37 ℃水解2 h，于4 ℃离心机离心20 min（12000 r/min），取上清得奶渣样品液。

1.2.5.2 对DPPH自由基的清除作用 用无水乙醇配制浓度为0.1 mmol/L的DPPH溶液，取制备好奶渣样品，将样品和DPPH溶液混匀，于室温下避光放置30 min后，在518 nm处测定吸光度A1，无水乙醇和DPPH溶液的吸光度为A0，样品和无水乙醇的吸光度为A2平行测定3次，按下列公式计算清除率[13]。

样品DPPH 自由基清除能力以每g样品中当量Trolox的mmol量表示。

式中：c表示标曲读数；100表示每100 g标准品中含有Trolox的量，mmol；n表示稀释倍数;m 表示奶渣质量，g；V 表示反应体系总体积，mL。

1.2.5.3 超氧阴离子自由基清除作用 用蒸馏水配制50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.2），用0.01 mol/L的HCl配制0.3 mmol/L的邻苯三酚溶液。自氧化速率V0的测定：在试管中加入5 mL Tris-HCl缓冲液，25 ℃恒温水浴中放置20 min，再加入0.5 mL邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，在325 nm处测定A值，每反应30 s记录一组，共反应5 min。将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V0。奶渣样品清除超氧阴离子速率V1的测定：在试管中加入5 ml Tris-HCl缓冲液，加入1 mL蒸馏水，1 mL奶渣样品于25 ℃恒温水浴中放置20 min，再加入0.5 mL邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，在325 nm处测定A值，每反应30 s记录一组，共反应5 min。将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，做直线回归得到的斜率表示奶渣样品液清除超氧阴离子的速率V1。清除率计算公式为[14]：

1.2.5.4 羟基自由基清除作用 用蒸馏水配制pH=7.4、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，5 mmol/L的邻菲罗啉，7.5 mmol/L的硫酸亚铁以及1%的过氧化氢溶液。在试管中分别加入2 mL磷酸盐缓冲液，0.3 mL邻菲罗啉溶液，充分混匀后，加入0.2 mL FeSO4溶液，每加一管后立即混匀。然后向其中加入奶渣样品液，混匀，再加入2 mL H2O2，最后补充体积至8 mL。另再做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入1 mL H2O2，未损伤管不加H2O2，最后补充各管体积至8 mL。于37 ℃下保温1 h，在536 nm下测定吸光值，计算清除率，其计算公式为[15]：

式中：A0表示未损伤管的吸光值；A1表示损伤管的吸光值；A2表示加样品液的吸光值。

1.2.5.5 铁离子还原抗氧化能力（FRAP） 用蒸馏水配制pH=3.6的醋酸钠缓冲溶液，20 mmol/L的三氯化铁，用40 mmol/L的HCl配制10 mmol/L的2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）。将醋酸钠缓冲液、三氯化铁、TPTZ按10:1:1的比例混合制得工作液。取0.5 mL 70%乙醇，0.5 mL奶渣样品液，9 mL工作液混合于37 ℃下恒温培养10 min，以缓冲液为空白，测其在593 nm下的吸光度值，计算公式为[16]：

式中：C表示标曲读数；V1表示奶渣多肽样品液总体积，mL；V2表示所测样品体积，mL；m表示奶渣质量，g；10表示反应体系总体积，mL。

1.2.5.6 过氧化氢清除能力（H2O2） 用蒸馏水配制0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=7.4），用缓冲溶液配制4 mmol/L过氧化氢，4.5 mmol/L苯酚红，用苯酚红溶液配制300 μg/mL HRPase得HRPase-苯酚红溶液。取2 mL奶渣样品液与800 μL过氧化氢混合，室温培养20 min，以蒸馏水为对照，再加入1200 μL HRPase-苯酚红溶液室温培养10 min，用分光光度计在610 nm下测吸光度值，计算公式如下[17]：

1.3 数据分析

每个样品实验重复3次，采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析，结果表示为“平均值±标准差（Mean±SD）”，SPSS 22.0进行方差分析与显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同海拔牦牛奶渣基本营养成分比较

由表1、表2可知，奶渣中含有相当丰富的营养物质，主要成分为蛋白质（>48 g/100 g）、脂肪（≥3 g/100 g）、灰分（>4 g/100 g）、水分（>9 g/100 g）以及钙（>7 g/kg）、铁（>17 g/kg）、磷（>1 g/kg）等，且随海拔的升高，蛋白质、铁和维生素E的含量显著升高（NA

表1 三种奶渣基本营养成分含量比较Table 1 Comparison of the contents of basic nutrients in three kinds of milk dregs

表2 三种奶渣氨基酸含量（g/100 g）比较Table 2 Comparison of amino acid content of three kinds of milk dregs (g/100 g)

2.2 不同海拔牦牛奶渣热力学特性比较

如图1所示，三种奶渣具有相似的熔化吸热峰，且各个峰对应的熔化吸热范围基本保持一致。NA、NB、NC三种奶渣分别对应的温度范围为137.23～163.31 ℃、85.48～187.68 ℃、132.98～165.66 ℃，极值温度分别为148.12、129.68、148.39 ℃，吸热量分别为116.6、184.1、116.4 J/g，其中海拔2500～2800 m和4300 m以上的奶渣的极值温度都明显高于3500～4000 m的奶渣，推测可能是2500～2800 m和4300 m以上在水分含量以及组成成分差异所致[24−25]，对于同种物质而言，水分含量越低，其极值温度越低，吸热量越高，这与前文2.1部分研究结果显示NA、NC与NB成分差异结果一致。三种奶渣热力学特性差异直接影响其应用食品产品加工过程对产品品质影响，如将这三种奶渣应用于奶渣包子加工，因这三种奶渣热力学差异可能会导致奶渣包子加热后质构品质的差异。

图1 不同海拔奶渣NA（a）、NB（b）和NC（c）熔化曲线Fig.1 Melting curves of NA (a), NB (b) and NC (c) of milk dregs at different elevations

2.3 不同海拔牦牛奶渣黏弹特性比较

图2是不同海拔奶渣打磨成粉后的频率扫描曲线。贮能模量G′表示奶渣在应力能量贮存后可以恢复的弹性性质；损耗模量G′′代表能耗不可恢复的黏性性质；损耗模量（G′）与贮能模量（G′）的比值为损耗角正切值tanδ。由图2a可知，随频率的增大，G′逐渐增大，在3个不同海拔中，奶渣G′随海拔的上升而增加，说明随海拔的增加，奶渣在能量贮存后可恢复的弹性性质也在逐渐增加；图2b表明三种不同海拔奶渣的tanδ在频率0.01～0.1 rad/s下逐渐降低，在0.1～100 rad/s下随频率的增大而增大，且在3500～4000 m海拔下的奶渣tanδ显著高于海拔4300和2800 m处的奶渣，黏性比例更大，显示出更强的流动性。

图2 不同海拔奶渣储能模量（a）和tanδ（b）随频率变化曲线图Fig.2 Curves of energy storage modulus (a) and tan δ (b) of milk dregs with frequency at different elevations

2.4 不同海拔奶渣挥发性成分差异比较

由图3和表3可知，奶渣主要挥发性成分共有8类，包括醛类、酸类、烯烃类、酮类、烷烃类、酚类、醇类和苯环及其他类。奶渣中主体香型呈水果香味，奶渣NA共有24种风味物质，主要挥发性成分包括壬醛（42.49%）、辛醛（11.52%）、壬酸（5.09%）、柠檬烯（4.98%）等；奶渣NB共有27种风味物质，主要呈香物质是壬醛（26.03%）、庚醛（9.88%）、辛醛（9.68%）、壬酸（6.93%）、D-柠檬烯（6.28%）、（E）-壬烯醛（4.97%）等；奶渣NC共有15种风味物质，主要呈香物质是月桂烯（21.92%）、己醛（24.57%）、2，3-丁二醇（15.36%）、壬醛（9.1%）、苯乙醇（5.52%）、β-月桂烯（5.39%）、香茅醛（4.57%）。结果表明在三种奶渣当中，其共有挥发性成分是壬醛、苯甲醛、4,4'-(1-甲基亚乙基)双酚、苯乙醇和邻二氯苯，表明奶渣普遍存在玫瑰、柑橘香（参考表3，主要挥发性成分壬醛呈现的香气）。而对于三种奶渣显著差异挥发性组分，主要体现在壬醛（NA最高）、己醛（NC最高）、月桂烯（NC最高）、2,3-丁二醇（NC最高）、辛醛（NA最高）。且不同海拔对奶渣挥发性成分影响显著，海拔越高，奶渣挥发性成分越简单、纯正，譬如奶渣果香更为纯正。结果亦表明，牦牛奶渣挥发性组成主要是醛类（最小相对百分含量Vmin>30%），乳品中的醛类一般由油酸、亚油酸、亚麻酸、二十二碳六烯酸等不饱和脂肪酸脂肪氧化产生[26]，尤其是己醛则有油酸和亚油酸经脂肪氧化产生，说明牦牛奶含有较高的不饱和脂肪酸，这与黄世群等报道的结果一致[26]。在牦牛奶加工成奶渣过程中，由于不饱和脂肪酸氧化作用产生上述醛类，构成了牦牛奶渣主体风味，而奶渣NC可能原料乳中含有更高比例的油酸和亚油酸，所以其在加工过程产生带有青草香味的己醛单体[27]。牦牛奶渣具有花香的特征对其应用于乳制品加工、西藏特色休闲食品非常重要，因为可以为其提供吸引人的香气[28]。

图3 三种不同海拔的奶渣挥发性组分含量对比图Fig.3 Comparison of volatile components in milk dregs at three different elevations

2.5 不同海拔奶渣抗氧化活性比较

由图4所示，西藏牦牛奶渣均有不同程度的抗氧化能力，包括DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基清除能力，对铁离子螯合抗氧化能力以及对过氧化氢清除能力，这与王高等[29]报道的结果一致。然而，不同海拔对奶渣的抗氧化活性有明显影响，与海拔2500～2800 m处的奶渣NA相比，随着海拔的增加，奶渣的DPPH自由基清除能力逐渐增强，NC的DPPH自由基清除能力最强（228 mmol/100 g）（图4a）。NB的超氧阴离子清除能力显著高于NA（P<0.05），与NC差异不显著（P>0.05）（图4b）。不同海拔之间羟基自由基清除能力没有显著差异（P>0.05）（图4c）。与海拔3500～4000 m处的奶渣NB相比，海拔为2500～2800 m和4300 m以上的奶渣铁离子螯合抗氧化能力（FRAP）更高（P<0.05），约为NB的2倍（图4d）。而过氧化氢清除能力却随海拔的增加而降低（图4e）。造成不同海拔的奶渣抗氧化活性的差异的原因可能主要来源于其组分的差异，奶渣中抗氧化活性成分主要是蛋白质、多肽、不饱和脂肪酸、维生素等[30−31]，蛋白质和多肽抗氧化活性与其结构中氨基酸的组成有关，譬如蛋白质和多肽中组氨酸、酪氨酸、色氨酸等氨基酸具有抗氧化功能活性，而不饱和脂肪酸和维生素具有抗氧化活性，可能与其结构中不饱和双键或三键具有一定相关性。表2也证实NC比NA和NB在组氨酸和酪氨酸含量方面更高，一定程度反映奶渣抗氧化活性与其氨基酸组成和含量有关。

表3 三种奶渣挥发性组分相对含量Table 3 Comparison of volatile components contents from three kinds of milk dregs

图4 不同海拔奶渣对DPPH自由基（a）、超氧阴离子（b）和羟自由基（c）清除能力，对铁离子螯合抗氧化能力（d）以及对过氧化氢（H2O2）清除能力（e）Fig.4 Scavenging ability of milk dregs at different elevations to DPPH free radical (a), superoxide anion (b) and hydroxyl free radical(c), iron ion chelating antioxidant ability (d) and hydrogen peroxide (H2O2) scavenging ability (e)

3 结论

西藏牦牛奶渣理化、营养、风味均受到海拔显著影响（P<0.05），抗氧化功效也随海拔的变化而变化。相较于奶渣NA和NB，高海拔奶渣NC的平均蛋白质含量（71.00 g/100 g）、维生素A含量（3.52 μg/100 g）、维生素E含量（0.33 mg/100 g）、维生素D3含量（0.66 μg/100 g）、铁元素含量（55.51 g/kg）、总氨基酸含量（79.32 g/100 g）和必需氨基酸含量（36.40 g/100 g）最高。相较于奶渣NA和NC，奶渣NB极值温度（129.68 ℃）最低，而tanδ最高，说明奶渣NB流动性最佳。三种奶渣当中，其共有挥发性成分是壬醛、苯甲醛、4,4'-(1-甲基亚乙基)双酚、苯乙醇和邻二氯苯，表明奶渣普遍存在玫瑰、柑橘香。而对于三种奶渣显著差异挥发性组分，主要体现在壬醛、己醛、月桂烯、2,3-丁二醇、辛醛。牦牛奶渣具有较好抗氧化活性，奶渣NC具有最强DPPH自由基清除能力，奶渣NA具有最强过氧化氢清除能力。本研究为全面认识西藏牦牛奶渣提供依据，对开发西藏少数民族地区特色乳制品有一定的参考价值。