不同粗糙度钛表面形貌对人牙龈成纤维细胞黏附及整合素α5基因表达的影响

吕吉利 宣丽娜 冯丹峰 黎红*

种植义齿具有“人类第三幅牙齿”之称［1］，是目前最受欢迎的缺牙修复方式之一。近期研究发现种植术后种植体周围炎以及种植体周围黏膜炎发生率达19.83%和46.83%［2］，是导致种植体失败的主要原因之一。种植体-软组织界面的结缔组织具有支持、免疫监控、促进修复等作用［3］，研究表明种植体周围软组织封闭水平弱于天然牙［4］，这种较弱的软组织封闭水平可能是导致种植体失败的原因之一。整合素作为牙龈成纤维细胞黏附过程中重要的蛋白，较多研究证实通过不同的种植体表面处理方式可以促进整合素的基因表达，其中物理改性是较为安全稳定的方法之一［5］。本文探讨不同粗糙度钛表面形貌对人牙龈成纤维细胞黏附及整合素α5基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料 无水乙醇、蒸馏水、37%浓盐酸、浓硫酸、氧化铝细砂（绿新源）、钛圆盘（柏泰）、PBS溶液（诺森德）、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美国）、胎牛血清（四季青）、CCK8试剂盒（碧云天）、DMEM培养液（Gibco，美国）、Trizol（Takara）、反转录试剂盒（Takara RR047）、PCR试剂盒（Takara RR420）。

1.2 试件制备及表征 将直径15 mm、高度1 mm的100枚钛圆盘随机分为A组、B组、C组及D组，A组采用机械抛光处理，记为Ti组，B组、C组及D组分别采用直径45 µm、125 µm及250 µm的氧化铝细砂进行表面喷砂处理（JNSP-Ⅰ型湿喷砂机，压力：0.4 MPa，距离7 cm，时长：1 min）。将所得钛圆盘经蒸馏水冲洗、超声20 min后进行热酸蚀处理。B组采用低浓度混合酸（60% H2SO4：10% HCL：蒸馏水按1∶1∶2混匀）100 ℃水浴20 min，蒸馏水冲洗后分别经蒸馏水、75%乙醇、蒸馏水超声10 min，高温高压蒸汽灭菌后保存备用，记为Ti45组。C组及D组采用高浓度混合酸（50% H2SO4∶10% HCL按1∶1混匀）100 ℃水浴20 min，蒸馏水冲洗后分别经蒸馏水、75%乙醇、蒸馏水超声10 min，分别记为Ti125组及Ti250组，高温高压蒸汽灭菌后保存备用。

1.3 从4组试件中分别随机抽取5枚钛圆盘，每枚钛圆盘分别选取上中下三个测试位点，利用探针式轮廓测试仪检测表面粗糙度（Ra）。记录后进行统计学分析。

1.4 牙龈成纤维细胞获得 在经过志愿者知情同意后，取因正畸或阻生齿需拔牙或需冠延长手术且牙龈无炎症患者（12~35岁）的牙龈组织（经浙江中医药大学伦理委员会批准）。采用改良组织块培养法进行原代培养，5 d左右观察细胞爬出后更换含10%胎牛血清的DMED培养液并去除漂浮组织块及杂质。细胞铺满培养瓶底80%时常规按1∶2传代，3~5代细胞采用含10% DMSO的胎牛血清冻存于液氮中备用。

1.5 细胞分离率 将消毒后钛圆盘试件治愈超净工作台上紫外灯照射下过夜，每组取6个钛圆盘放置于24孔板中，将处于对数生长期的3~6代细胞以3×104/ml浓度接种至24孔板内，每孔1 ml，置于CO2培养箱内经24 h培养稳定后，小心吸出原培养液并用PBS溶液冲洗后吸净，加入稀释后的0.125%的胰酶溶液1 ml，并于摇床上以150 r/min速度作用1 min，培养液终止消化，小心吸出四组液体分别移入EP管中，剩余钛片上再次加入1 ml稀释胰酶溶液，作用1 min后终止消化，并用1000 ml移液枪反复吹打钛圆盘，收集剩余四组液体，将2次液体1500 r/min、5 min离心，弃上清液，重复3次，每支EP管中加入200 µl培养液，小心吹打均匀，并接种于96孔板中，置入CO2培养箱中，24 h后细胞生长稳定，吸出原培养液，加入PBS小心清洗并吸净，每孔加入100 µl DMEM培养液及10 µl CCK8试剂，周围空白孔用100 µl培养液充填，置于CO2培养箱中孵育1 h，酶标仪测量450 nm波长处吸光度OD值，重复测量3次，将初始消化后OD值记为A1，最终消化后OD值记为A2，并按照公式计算细胞分离率：细胞分离率=A1/（A1+A2）×100%。分离率与黏附强度成反比，细胞黏附强度可进一步计算经胰酶及摇床处理后存留在钛圆盘的细胞量与总细胞量比值表示，按公式进行计算：细胞黏附强度=A2/（A1+A2）×100%。

1.6 整合素α5的mRNA表达 相同加工方法制作直径为15 mm的各组试件，消毒后置于24孔板中，每组5个孔，每孔接种HGF 3×104个，培养至细胞生长稳定。钛片试件用新镊子小心移至新24孔板中，PBS冲洗，吸干，每孔加200 µl Trizol，收集每组5个孔的trizol裂解液至EP管中，抽提总RNA，Nano Drop 2000测定各组总RNA浓度，反转录为cDNA，以GAPDH作为内参，按照Takara RR420条件要求严格进行实时荧光定量PCR（qPCR），各引物序列及大小见表1。重复3次/组，每次每组每基因3个复孔。LightCycler 480软件导出各组CT值。以光滑钛组为对照组，采用2-△△CT法计算整合素α5的mRNA的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 实时荧光定量PCR引物序列及产物大小

2 结果

2.1 四组材料表面粗糙度比较 见表2。

表2 四组材料表面粗糙度比较（±s）

表2 四组材料表面粗糙度比较（±s）

注：与Ti组比较，*P<0.05；与Ti45组比较，#P<0.05；与Ti125组比较，△P<0.05；与Ti250组比较，▲P<0.05

组别 n 粗糙度（µm）Ti组 10 0.09±0.03#△▲Ti45组 10 0.47±0.03*△▲Ti125组 10 1.65±0.05*#▲Ti250组 10 2.93±0.06*#△

2.2 四组扫描电镜观察结果 Ti组钛试件并非完全光滑，其表面可见细微划痕分布。其余三组粗糙表面可见大量微米级凹坑分布，呈两级分布，较大的一级凹坑及较小的二级凹坑。二级凹坑均匀分布于一级凹坑内或一级凹坑间。Ti45组表面一级凹坑较小，直径大约2 µm，而Ti250组表面一级凹坑直径较大，约2~3 µm，Ti125组位于两组之间。见图1。

图1 四组材料扫描电镜观察（×5000）

2.3 四组细胞黏附强度比较 Ti组细胞黏附强度高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.4 四组HGF整合素α5 mRNA表达比较 Ti组、Ti45组、Ti125组及Ti250组整合素α5的mRNA表达量依次降低，且Ti组高于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

图2 四组黏附强度比较

图3 四组整合素mRNA表达情况

3 讨论

随着研究的不断深入，对于种植体周围病的认识进一步加深。口腔内拥有超过10,000种细菌表型［6］，细菌的大量聚集会导致种植体周围黏膜炎甚至种植体周围炎的发生，如何加强种植体周围软组织封闭作用成为目前的研究热点。表面改性是增强软组织黏附作用的有效方法［7］，阳极氧化、光功能化、微弧氧化、微沟槽处理、喷砂酸蚀法等是目前研究的主要方向［8］，哪种方法最有效目前尚未有定论。表面形貌对于细胞黏附、爬行及生长具有重要影响，而表面粗糙度是表面形貌的重要指标之一。有研究认为微粗糙的表面增加表面能及表面积，更易于体液中的大分子物质沉积吸附，从而增加细胞的黏附点［9］。本课题组通过喷砂酸蚀法成功获得具有四种典型粗糙度的钛圆盘试件，各组间粗糙度差异有明显统计学意义（P<0.05）。

牙槽骨是终生处于动态变化的，种植体边缘骨受生理及病理因素的影响而出现吸收，为了维持生物学宽度导致结合上皮的根向迁移。HERMANN［10］通过X线片发现种植体边缘骨在Ⅱ期手术暴露种植体及安放愈合基台后会发生改建，导致边缘牙槽骨吸收至种植体-基台界面下方，为了维持种植体生物学宽度的稳定，软组织随之改建，导致上皮根向迁移，经过这一系列的改建，结缔组织最终部分或全部迁移至种植体粗糙颈部。目前为了获得良好的骨结合，绝大多数种植体采用经过各种表面处理得到的粗糙表面，Straumann公司提出大颗粒喷砂酸蚀法得到的粗糙SLA表面形貌是目前主流的种植体表面之一。寻找一种合适粗糙度的种植体表面在不影响骨结合的同时增强软组织黏附及减少菌斑附着具有重要意义。

目前研究发现种植体周围软组织愈合与天然牙的软组织屏障存在明显不同。种植体周围的软组织愈合形式实际上是一种异物反应，最终形成类似于“瘢痕”组织［11］，对于机械力的抵抗作用更弱。KOKUBU［12］研究表明SLA表面可以增强牙龈成纤维细胞的黏附，但也有学者［13］认为光滑表面更利于成纤维细胞的黏附铺展。本课题组前期研究发现了相似的结果，相比于粗糙表面，较为光滑的Ti组表面的牙龈成纤维铺展面积更大，细胞相互连接成网状，而粗糙表面细胞则生长方向各异，铺展面积不如光滑表面，但细胞呈三维立体状黏附于材料表面，这导致细胞需要更多时间适应粗糙表面，且不利于细胞的爬行［14］。本实验通过细胞分离率发现牙龈成纤维细胞在低粗糙度的Ti组表现出更强的黏附能力。表明表面形貌导致细胞铺展形式不一，Ti组细胞铺展更完全，利于细胞的黏附，与前期扫描电镜下观察到的细胞铺展情况相一致。

整合素是存在于细胞膜表面的一种跨膜蛋白，由α亚基及β亚基组成的异质二聚体，目前研究发现18种α亚基及8种β亚基［15］，几乎所有细胞表面都存在至少一种整合素。成纤维细胞表面主要表达整合素α5β1亚型。进一步的研究发现整合素可能通过细胞外基质-整合素-细胞骨架系统形成双向的力学传导系统［16］。表面形貌的改变会对细胞产生一定的力学刺激，通过整合素向内传导影响相关基因表达，调节细胞骨架使细胞产生形变并影响细胞的黏附［17］。本实验发现Ti组整合素α5的mRNA表达明显高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05）。这可能与粗糙表面主要以微米级形貌改变相关，对于牙龈成纤维细胞的形态改变影响较大，细胞铺展面积减少导致细胞黏附点减少，进而导致整合素α5的mRNA表达减少。此外，亲水性可能也是导致整合素α5基因表达降低的原因。本课题组前期实验发现，随着粗糙度的增加，亲水性降低［14］，而亲水性的降低会导致体液中的蛋白等基质的吸附降低，而成纤维细胞的黏附需要通过整合素等与细胞外基质的特异性位点识别并结合，因此可能导致整合素α5的表达降低。

综上所述，在四组不同粗糙度钛试件组中，Ti组（Ra=0.09±0.03 µm）牙龈成纤维细胞表现出更强的黏附强度，过度增加粗糙度不利于牙龈成纤维细胞的黏附生长。通过RTq-PCR检测发现随着粗糙度的增加，整合素α5的基因表达降低，且Ti组整合素α5表现出较高的基因表达水平（P<0.05），推测由于粗糙度的增加导致亲水性降低有关。同时有学者［18-19］提出纳米级或微纳米级表面对于牙龈成纤维细胞的增殖有明显促进作用。未来将进一步研究纳米级表面形貌对于牙龈成纤维细胞黏附及相关基因表达的影响。