基于网络药理学的四妙勇安汤治疗深静脉血栓形成机制研究

刘 湘，张 玥，公茂旺，刘效敏，赵亚男

（1.山东中医药大学，山东 济南250014；2.山东中医药大学附属医院周围血管病科，山东 济南250014；3.泰安市中医二院，山东 泰安271000；4.山东中医药大学附属医院运动损伤骨科，山东 济南250014）

深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是以肢体突发粗肿、胀痛为临床表现的静脉回流障碍性疾病，中医学认为DVT属于“股肿”“脉痹”“瘀血流注”等范畴。瘀热互结之病机始终存在于DVT的病变过程中，因此清热解毒、凉血散瘀为首要治法［1］。四妙勇安汤是治疗热毒炽盛之脱疽的经典名方，由金银花、玄参、当归、甘草4味中药组成，因其具有的清热解毒、活血通络之功效契合瘀热互结之病机而被常用于治疗包括DVT在内的各种周围血管疾病，并取得了显著疗效［2⁃4］。但是四妙勇安汤治疗DVT的机制尚需进一步探究。

网络药理学是一门运用网络对药物与疾病进行分析且融合多项学科的新兴学科，具有整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点［5］。本文运用网络药理学方法，整合分析数据库中药物与疾病的信息，构建药物⁃靶点⁃疾病网络，以探究四妙勇安汤治疗DVT的作用机制。

1 资料与方法

1.1 四妙勇安汤有效成分筛选

通过检索TCMSP数据库获取四妙勇安汤中金银花、玄参、当归、甘草的有效成分，按照口服生物利 用 度（oral bioavail⁃ability，OB）≥30，类 药 性（drug⁃likeness，DL）≥0.18的条件对有效成分进行筛选。

1.2 有效成分作用靶点获取

通过TCMSP数据库挖掘有效成分的作用靶点，并通过Uniprot数据库将作用靶点的名称作标准化处理。

1.3 DVT靶点的获取

在CTD数据库中以“deep venous thrombosis”为关键词检索DVT的相关靶点，并以“inference score≥30”为条件对获得的靶点进行筛选。

1.4 蛋白质⁃蛋白质相互作用（PPI）网络构建

通过EXCEL将有效成分作用靶点与DVT靶点取交集，去除重复值后得到四妙勇安汤治疗DVT的关键靶点。通过STRING数据库对蛋白质之间的相互作用进行预测，得到关键靶点之间的关系。

1.5 构建药物⁃成分⁃靶点⁃疾病网络图

使用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物⁃成分⁃靶点⁃疾病”网络。网络中的节点（Node）分别代表中药、成分、靶点与疾病，节点之间通过边（Edge）来连接。根据节点度值（Degree）的大小筛选出网络的核心节点。

1.6 四妙勇安汤治疗DVT通路富集分析

运用Cytoscape 3.7.2中CluoGO v2.5.5插件GO Biological Process来分析四妙勇安汤有效成分治疗DVT靶点生物过程，运用KEGG以“P<0.01”对获取的治疗DVT的通路进行富集分析。

2 结果

2.1 化学成分筛选

根据筛选条件，在TCMSP中筛选出金银花有效成分23个，玄参有效成分9个，当归有效成分2个，甘草有效成分93个。除去重复的有效成分后，共得到四妙勇安汤121个有效成分。

2.2 有效成分作用靶点

获取金银花有效成分作用靶点122个，玄参55个，当归64个，甘草125个。将靶点合并去除重复值后，共获得137个作用靶点。

2.3 DVT相关靶点

从CTD数据库中以“deep venous thrombosis”为关键词、以“inference score≥30”为条件筛选获取与DVT相关靶点1 172个。

2.4 PPI网络构建与分析

经过取交集并去除重复值后，获得关键靶点80个，并绘制维恩图，见图1。在STRING数据库中输入四妙勇安汤治疗DVT的关键靶点，获得关键靶点的PPI网络，以及靶点之间的关系，见图2。该网络共包含节点80个，边925条，平均度值为23.13。度值越高表示该节点所代表的靶点在网络中的作用越高。将相互连接的靶点导入Cytoscape 3.7.2进行分析，结果显示IL6、TP53、EGF、VEGFA、JUN、TNF、EGFR、MAPK1、ESR1等靶点度值较高，作用较为重要。

2.5 药物⁃成分⁃靶点⁃疾病网络构建

图1 四妙勇安汤有效成分作用靶点与DVT相关靶点交集Fig 1 Intersection of the effect targets of active compo‑nents of Simiao Yong'an Decoction and DVT‑re‑lated targets

运用Cytoscape 3.7.2构建药物⁃成分⁃靶点⁃疾病网络，见图3。网络由193个节点组成，其中4个中药节点、108个成分节点、80个靶点节点和1个疾病靶点，六边形代表疾病节点，椭圆形代表中药节点，菱形代表成分节点，矩形代表靶点节点。节点的Degree值越大，说明节点在网络中的重要性越大。根据Degree值大小筛选出核心成分和靶点，结果显示，槲皮素（quercetin）、β⁃谷甾醇（beta⁃sitosterol）、山奈酚（kaempferol）等有效成分以及雌激素受体1（es⁃trogen receptor 1，ESR1）、雄激素受体（androgen re⁃ceptor，AR）、前列腺素G/H合成酶2（prostaglandin G/h synthetase 2，PTGS2）等靶点是该网络的核心节点，表明这些节点是四妙勇安汤治疗DVT的重要成分或靶点，见表1。

表1 四妙勇安汤治疗DVT的核心节点Tab 1 Core nodes of Simiao Yong'an Decoction in the treat⁃ment of DVT

图2 关键靶点PPI网络Fig 2 PPI network of key targets

2.6 药物⁃成分⁃靶点⁃疾病通路分析

通过ClueGO将四妙勇安汤治疗DVT的生物过程和通路进行分析，运用GO Biological Process并选择P<0.01的生物过程，共214条，关键靶点富集显著的前5条生物过程，为对无机物的反应（33个靶点），细胞成分运动的正向调节（29个靶点），对有毒物质的反应（29个靶点），细胞迁移的正调控（28个靶点），氧化应激反应（27个靶点），见表2。证明四妙勇安汤治疗DVT的作用可通过参与多种生物过程而达到。

图3 四妙勇安汤治疗DVT的药物⁃成分⁃靶点⁃疾病网络Fig 3 Drug‑component‑target‑disease network of Simiao Yong'an Decoction in the treatment of DVT

运用KEGG进行通路富集分析，以P<0.01共得到72条通路，见图4。结果表明，晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGE）⁃糖基化终末产物受体（receptor of AGE，RAGE）信号通路、PI3K⁃Akt信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）信 号 通路、白细胞介素⁃17（IL⁃17）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、松弛素（re⁃laxin，RLX）信号通路等通路是关键靶点显著富集的通路。

表2 四妙勇安汤治疗DVT关键靶点的生物过程分析Tab 2 Biological process analysis of key targets of DVT treated by Simiao Yong'an Decoction

图4 KEGG获得的药物⁃成分⁃靶点⁃疾病通路Fig 4 Drug‑component‑tar get‑disease pathway obtained by KEGG

3 讨论

四妙勇安汤原载于鲍相璈所著的《验方新编》，是《古代经典名方目录（第一批）》中的经典名方之一［6］。方中金银花味甘性寒，尤善清热解毒；玄参长于清热凉血，泻火解毒；当归养血活血；甘草清热解毒，调和诸药。全方共奏清热解毒、活血止痛之功。研究结果显示，槲皮素、β⁃谷甾醇和山奈酚等为四妙勇安汤治疗DVT的重要有效成分，可通过作用于ESR1、AR、PTGS2等关键靶点和参与AGE⁃RAGE信号通路、PI3K⁃Akt信号通路、MAPK信号通路、IL⁃17信号通路、TNF信号通路、RLX信号通路等达到治疗DVT的作用。

四妙勇安汤的有效成分：槲皮素是一种多醇羟基黄酮类化合物。Sapha等［7］通过运用槲皮素治疗I型糖尿病小鼠模型的研究，发现槲皮素能够抑制血小板聚集以及血小板致密颗粒胞吐作用，降低血液的黏滞程度，延迟血栓的形成。β⁃谷甾醇是一种广泛存在于各种植物油、坚果等植物种子中的植物甾醇，有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用［8］。牙启康等［9］将榕树须抗血栓作用的活性部位分离后得到的7个化合物，其中就包括β⁃谷甾醇，证实了其抗血栓的作用。Choi等［10］证实β⁃谷甾醇能够减少TNF⁃α、IL⁃1β等炎性因子的分泌，发挥其抗炎作用。另有研究表明，β⁃谷甾醇在体外具有溶栓活性，在体内能够发挥抗凝活性［11］。山奈酚是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物。研究发现，山奈酚能够抑制纤维蛋白聚合物的形成，减弱凝血酶刺激血小板中细胞外信号调节激酶1/2等酶的磷酸化，延迟凝血时间［12］。这3种有效成分在药物⁃成分⁃靶点⁃疾病网络中作用的靶点多，度值较高，具有抗凝、抗炎、溶栓的药理作用，是四妙勇安汤治疗DVT的重要成分。

作用关键靶点：ESR1、AR、PTGS2等是网络中的核心关键靶点。ESR1是雌激素受体的一种亚型。研究表明，ESR1能够调节血小板前体蛋白的代谢，抑制血小板β淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）生成，而血小板Aβ的过度生成可导致血管内皮细胞受损，因此ESR1对血管内皮细胞具有保护作用［13］。AR是一种主要分布于睾丸间质细胞的核受体。研究发现，雄激素能够调控雄激素依赖性组织因子途径抑制物调节蛋白（ADTRP）的水平，起到防治冠状动脉疾病、血栓形成等疾病的作用［14］。PTGS2基因的表达产生环氧合酶⁃2（cyclooxygen⁃ase⁃2，COX⁃2），环氧合酶（cyclooxygenase，COX）参与花生四烯酸合成血栓素A2的过程，进而促进血小板聚集。正常情况下COX⁃2的表达量很低，当血管壁受损或者受到多种炎性因子刺激时，血管平滑肌细胞COX⁃2的表达就会增多［15］。这些靶点是有效成分作用较多的靶点，与血管内皮、血栓形成、血小板聚集密切相关，为四妙勇安汤治疗DVT的核心靶点。

信号通路：AGE⁃RAGE信号通路与炎性细胞因子、氧化应激、血管等多方面密切相关［16］。AGE与RAGE的特异性结合能够诱导一系列信号传导途径，引发血管收缩、炎症反应等，从而导致血栓形成［17］。PI3K⁃Akt和MAPK信号通路在血小板聚集活化中发挥着重要作用［18，19］。血小板受到激动剂刺激时，血小板表面的P2Y 1和P2Y 12受体与对应的G蛋白发生偶联，磷脂酰肌醇3激酶β（PI3Kβ）使PIP2磷酸化生成PIP3，PIP3能够激活PI3K的下游蛋白Akt，从而导致血小板活化聚集以及血栓形成等反应［20］。MAPK由ERK、JNK等蛋白组成，这些蛋白可在血小板中表达，磷酸化水平会在激动剂的刺激下升高，并参与调节血小板的活化聚集［21］。炎症反应与血栓形成同属宿主反应，炎症能促发血栓，而DVT中有炎症反应参与。炎性细胞因子作为炎症敏感标志物与DVT的发生密切相关［22］，IL⁃17信号通路和TNF信号通路均属炎性反应通路。IL⁃17是强大的促炎细胞因子，能够促进中性粒细胞的聚集和细胞因子的释放，推动炎症的发展［23］。TNF⁃α能够直接损伤血管内皮，诱导血管内皮细胞产生血小板活化因子（platelet activated fac⁃tor，PAF），抑制蛋白C活化，促使血栓形成［24］。研究发现，IL⁃17和TNF⁃α相结合时，可以增加血小板聚集，减弱抗凝作用，导致血栓形成［25］。因此，四妙勇安汤可以通过发挥抗炎作用，从而抑制血栓的蔓延。RLX是一种肽类激素，能够降低内皮细胞因子及黏附分子的表达和抑制单核细胞的黏附［26］，可以改善内皮依赖性血管反应，改善血管功能［27］。以上通路均为关键靶点显著富集的通路，与炎症反应、血小板聚集、血栓形成等关系密切，有效成分可能通过介导多条通路来发挥其药理作用治疗DVT，体现出四妙勇安汤多通路、多靶点的协同作用机制。

综上所述，四妙勇安汤中的多种成分可能通过作用于多个靶点和介导多项通路发挥抑制炎症反应、抗凝、保护血管内皮的作用，从而达到治疗DVT的效果。然因网络数据库中收录中药信息不完全、成分与靶点筛选上存在主观因素以及未进行实验研究，所以本研究存在一定的局限性，四妙勇安汤治疗DVT的作用机制还有待做深层次的研究加以验证。