葛根素通过circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4抑制SK-N-SH细胞氧糖剥夺损伤

齐献忠，邢英瀛，张小林，贾燕燕

南阳市中心医院 神经内科，河南 南阳 473000

脑卒中是导致残疾的主要原因，也是全球第2大常见的死亡原因[1]。约87%脑卒中病例为缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS），IS 的死亡率和致残率一直处于较高水平[2]。有效保护神经元损伤在IS防治中至关重要[3]。葛根素是从豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi 的根中提取的异黄酮苷类物质，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[4]。葛根素被广泛用于治疗急性缺血性中风、心脏病和其他全身性疾病[5-6]。环状RNA（circRNA）通过微小RNA（miRNA）或与RNA 结合蛋白相互作用形成circRNA-miRNA-mRNA 复合物，在转录后基因表达的调节中起关键作用[7]。研究发现，circRNA 可能参与了IS 的发病过程，具有作为IS的新型诊断生物标志物和分子治疗靶点的潜力[8-9]。在IS 患者和动物模型中，circ-丝氨酸/苏氨酸蛋白扰动样激酶1（tousled-like kinase1，TLK1）表达明显上调，敲除circ-TLK1能够显著减少脑梗死体积，减少缺血性神经元损害并改善神经功能缺损[10]。因此，本研究基于circ-TLK1 探究葛根素对IS 的神经细胞保护作用及机制。

1 材料

1.1 细胞

人神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH 购自美国ATCC。

1.2 药品与试剂

葛根素（质量分数≥98%，批号110752-201912）购自中国药品生物制品检定所；DMEM 高糖培养基（批号1912）购自美国Hyclone 公司；胎牛血清（批号SN201909）购自美国Gibco 公司；Lipofectamine 3000转染试剂（批号L3000-015）购自美国Invitrogen公司；MTT（批号MKBP6775V）购自美国Sigma公司；circ-TLK1过表达载体及空载 Vector、circ-TLK1小干扰RNA（si-circ-TLK1）、siRNA 阴性对照（si-NC）、miR-367-3p模拟物（miR-367-3p mimics）、miR-367-3p抑制剂（miR-367-3p inhibitors）及相应对照、Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）过表达载体质粒和空载pcDNA 均由上海吉玛制药技术有限公司合成；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 检测试剂盒（批号20191120）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 检测试剂盒（批号20190608）购自上海酶联生物科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）细胞凋亡试剂盒（批号MK1020）购自日本Takara 公司；双荧光素酶标记试剂盒（批号E2920）、pmirGLO 载体（批号E1330）购自美国Promega 公司；RNA 结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP，批号KT102-01）购自美国Millipore 公司；TLR4 单抗、HRP 标记的IgG 二抗购自美国CST 公司；RIPA 裂解液（批号P0013）购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号PC0020）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器

CR21GⅡ型低温高速离心机购自日本日立公司；T-1186-340-LA 型超低温冰箱购自天地精仪科技；MAXM5 型多功能酶标仪购自美谷分子仪器；YXQ-LS-75G 型高压灭菌锅购自诺基仪器；流式细胞仪购自北京仪美信科技。

2 方法

2.1 细胞培养

SK-N-SH 细胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，于5% CO2、饱和湿度、37 ℃的培养箱中培养。

2.2 氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）对SK-N-SH 细胞存活率的影响

取处于对数生长期的SK-N-SH 细胞，以2×104/孔接种于6 孔板中，待细胞贴壁后使用PBS 洗涤3 次，用不含血清、无糖的DMEM 培养基，于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培养箱中分别培养6、12、24 h；将培养基更换成DMEM 高糖培养基，于5% CO2、饱和湿度、37 ℃的培养箱中培养24 h，建立OGD 细胞模型[11]。加入100 μL MTT 孵育4 h，弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO），振荡至结晶完全溶解，采用酶标仪测定490 nm 处的吸光度（A），计算细胞存活率。

2.3 细胞转染

取处于对数生长期的SK-N-SH 细胞，以2×104/孔接种于6 孔板中，培养12 h，待细胞融合度达到50%时，按照试剂盒说明书将circ-TLK1过表达载体及空载Vector、si-circ-TLK1（5’-GGACATCTCAAA- AAGGCAACA-3’）及si-NC、miR-367-3pmimics、miR-367-3pinhibitors 及相应对照、TLR4过表达载体质粒及空载pcDNA 转染至SK-N-SH 细胞。

2.4 MTT 法检测细胞存活率

取处于对数生长期的SK-N-SH 细胞，以2×104/孔接种于6 孔板中，培养12 h，加入不同质量浓度（20、40、80 µg/mL）的葛根素或用质粒转染，对照组加入不含药物的无糖DMEM 培养基，于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培养箱中培养12 h；将培养基更换成DMEM 高糖培养基，于5% CO2、饱和湿度、37 ℃的培养箱中培养24 h。按“2.2”项下方法检测细胞存活率。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况

按“2.4”项下方法处理细胞，收集细胞，分别加入Annexin V-FITC 和PI 染液，孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.6 ELISA 法检测上清液中IL-6 和TNF-α 水平

按“2.4”项下方法处理细胞，收集上清液，按ELISA 试剂盒说明书测定IL-6 和TNF-α 水平。

2.7 qRT-PCR 检测 circ-TLK1 和 miR-367-3p mRNA 表达情况

按“2.4”项下方法处理细胞，收集细胞，按照试剂盒说明书提取总RNA 并合成cDNA，进行qRT-PCR 分析。引物序列见表1，将U6作为miR-367-3p内参，将GAPDH作为circ-TLK1内参。

2.8 双荧光素酶标记实验检测荧光素酶活性

将包含miR-367-3p结合位点的circ-TLK1的野生型序列（WT-circ-TLK1）或不具有miR-367-3p 结合位点的突变体（MUT-circ-TLK1）插入pmirGLO载体，将质粒与miR-367-3p mimics或miR-NC共转染至SK-N-SH 细胞，采用双荧光素酶标记试剂盒考察荧光素酶活性。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.9 RIP 实验检测miR-367-3p 与circ-TLK1 和TLR4 结合关系

以预冷的PBS 洗涤SK-N-SH 细胞2 次，加入裂解液于冰上裂解，收集上清液，于 -80 ℃保存。制备重悬磁珠，加入IgG 或Ago2 抗体孵育，弃上清，以洗涤液洗涤3 次，加入免疫沉淀缓冲液，离心取上清，提取免疫沉淀的RNA，并通过qRT-PCR检测，以确认结合靶点的富集水平。

2.10 Western blotting 法检测TLR4 蛋白表达情况

按“2.4”项下方法处理细胞，收集细胞，加入RIPA 裂解液，提取蛋白，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，于5%脱脂牛奶封闭2 h，加入TLR4 抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；洗涤3 次后，加入HRP 标记的IgG 二抗，孵育2 h，使用ECL 试剂盒显色，采用Image J软件分析。

2.11 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。

3 结果

3.1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 细胞损伤

如图1-A 所示，随着OGD 作用时间的延长，SK-N-SH 细胞存活率显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），后续选择12 h 作为OGD 的处理时间。如图1-B～D 所示，与对照组比较，模型组细胞存活率显著降低（P＜0.001），凋亡率显著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，葛根素组细胞存活率显著升高（P＜0.05、0.01、0.001），细胞凋亡率显著降低（P＜0.01、0.001），IL-6 和TNF-α 水平显著降低（P＜0.01、0.001），表明葛根素对OGD 致细胞损伤具有保护作用，选择40 μg/mL 葛根素进行后续研究。

图1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 细胞损伤Fig.1 Puerarin inhibited SK-N-SH cells damage induced by OGD

3.2 过表达circ-TLK1 逆转葛根素对OGD 所致的SK-N-SH 细胞损伤的保护作用

如图2 所示，与对照组比较，模型组细胞circ-TLK1mRNA 表达水平显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，葛根素组细胞circ-TLK1mRNA 表达水平显著降低（P＜0.001），表明葛根素对OGD致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用可能与circ-TLK1的表达有关。转染过表达circ-TLK1后，细胞circ-TLK1mRNA 表达水平表达显著升高（P＜0.001），细胞存活率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.01），IL-6 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.01、0.001），表明过表达circ-TLK1能够逆转葛根素对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用。

图2 过表达circ-TLK1 逆转葛根素对OGD 所致的SK-N-SH 细胞损伤的保护作用Fig.2 Overexpression of circ-TLK1 reversed protective effect of puerarin on SK-N-SH cells injury induced by OGD

3.3 葛根素通过circ-TLK1 靶向调控miR-367-3p对OGD 所致的SK-N-SH 细胞损伤的保护作用

如图3 所示，采用生物信息学在线软件预测circ-TLK1的下游靶点，发现miR-367-3p和circ-TLK1间存在特异性靶向结合位点，提示miR-367-3p可能是circ-TLK1的直接靶点。采用双荧光素酶报告基因实验和RIP 实验验证miR-367-3p和circ-TLK1的靶向关系，结果显示，与miR-NC组相比，miR-367-3p 组WT-circ-TLK1 荧光素酶相对活性显著降低（P＜0.001），MUT-circ-TLK1 荧光素酶相对活性无明显改变；与IgG 组相比，Ago2组miR-367-3p和circ-TLK1的富集水平均显著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p可通过结合位点与circ-TLK1特异性结合。

图3 circ-TLK1 与miR-367-3p 靶向调控作用Fig.3 Targeted regulation of circ-TLK1 and miR-367-3p

与对照组相比，模型组miR-367-3pmRNA 表达水平显著降低（P＜0.001）；与si-NC 组相比，si-circ-TLK1组circ-TLK1mRNA 表达水平显著降低（P＜0.001），miR-367-3pmRNA 表达水平显著升高（P＜0.01）；与Vector组相比，circ-TLK1 组circ-TLK1mRNA 表达水平显著升高（P＜0.001），miR-367-3pmRNA 表达水平显著降低（P＜0.05），表明circ-TLK1能够靶向负调控miR-367-3p的表达。

如图4 所示，与对照组相比，模型组miR-367-3pmRNA 表达水平显著降低（P＜0.001）；与模型组相比，葛根素组miR-367-3pmRNA 表达水平显著升高（P＜0.001），表明葛根素对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用可能与miR-367-3p的表达有关。通过转染抑制miR-367-3p表达，结果显示，与葛根素＋anti-miR-NC 组相比，葛根素＋anti-miR-367-3p 组miR-367-3pmRNA 表达水平显著降低（P＜0.001），细胞存活率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.001），表明抑制miR-367-3p能够逆转葛根素对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用。

图4 葛根素通过促进miR-367-3p 表达对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤发挥保护作用Fig.4 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by promoting miR-367-3p expression

3.4 葛根素通过miR-367-3p 靶向调控TLR4 对OGD 所致的SK-N-SH 细胞损伤的保护作用

如图5 所示，采用生物信息学在线软件预测miR-367-3p的下游靶基因，发现miR-367-3p和TLR4间存在特异性靶向结合位点，提示TLR4可能是miR-367-3p的直接靶基因。采用双荧光素酶报告基因实验和RIP 实验验证miR-367-3p和TLR4的靶向关系，结果显示，与miR-NC 组相比，miR-367-3p组WT-TLR4 荧光素酶相对活性显著降低（P＜0.001），MUT-TLR4 荧光素酶相对活性无明显改变；与IgG 组相比，Ago2 组TLR4和circ-TLK1的富集水平显著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p可通过结合位点与TLR4特异性结合。

图5 TLR4 和miR-367-3p 靶向调控作用Fig.5 Targeted regulation of TLR4 and miR-367-3p

与对照组相比，模型组TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）；与miR-NC 组相比，miR-367-3p组miR-367-3pmRNA 表达水平显著升高（P＜0.001），TLR4 蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）；与 anti-miR-NC组相比， anti-miR-367-3p 组miR-367-3pmRNA 表达水平显著降低（P＜0.05），TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p能够靶向负调控TLR4表达。

如图6 所示，与对照组相比，模型组TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）；与模型组相比，葛根素组TLR4蛋白表达水平显著降低（P＜0.001），表明葛根素对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用可能与TLR4 表达有关。通过转染过表达TLR4，结果显示，与葛根素＋pcDNA 组相比，葛根素＋TLR4 组TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.001），细胞存活率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平显著升高（P＜0.001），表明过表达TLR4能够逆转葛根素对OGD致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用。

图6 葛根素通过抑制TLR4 表达对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤发挥保护作用Fig.6 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by inhibiting TLR4 expression

3.5 葛根素通过调控 circ-TLK1/miR-367-3p/ TLR4 抑制OGD 所致的SK-N-SH 细胞损伤

如图7 所示，与对照组相比，模型组TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）；与si-NC 组相比，si-circ-TLK1 组TLR4 蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）；与si-circ-TLK1＋anti-miR-NC 组相比，si-circ-TLK1＋anti-miR-367-3p 组TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，葛根素组TLR4 蛋白表达水平显著降低（P＜0.001）；与葛根素＋Vector 组相比，葛根素＋circ-TLK1 组TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.001）；与葛根素＋anti-miR-NC 组相比，葛根素＋anti-miR-367-3p 组TLR4 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。

图7 葛根素对circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 的调控作用Fig.7 Regulatory effect of puerarin on circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4

4 讨论

IS 为危害我国中老年人健康及生活质量的主要疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率及高复发率等特点[12-13]。研究发现，葛根中的葛根素可以改善血液循环并减少心血管和脑血管疾病；葛根素能够减少脑缺血再灌注引起的神经元损伤，并降低脑卒中神经细胞损伤过程[14-17]。本研究发现葛根素可以有效提高OGD 诱导的SK-N-SH 细胞存活率，降低细胞凋亡率，降低IL-6 和TNF-α 水平，表明葛根素对IS 神经细胞损伤具有保护作用。

CircRNA 在组织中特异性表达，具有高度同源性、结构稳定等特点[18-19]。本研究结果显示，OGD诱导的SK-N-SH 细胞中circ-TLK1mRNA 表达水平显著升高，与文献报道一致[10]；葛根素显著下调circ-TLK1mRNA 表达，过表达circ-TLK1能够逆转葛根素对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用，表明葛根素通过降低SK-N-SH 细胞中circ-TLK1表达，从而发挥抗脑卒中的作用。circRNA 通常被用作miRNA 的分子海绵来调节mRNA 表达。研究发现，miR-367-3p具有明显的抗IS 的作用[20]。本研究结果显示，miR-367-3p为circ-TLK1的靶miRNA，circ-TLK1可以负向调节miR-367-3p表达；模型组SK-N-SH 细胞miR-367-3pmRNA 表达水平明显降低，葛根素显著上调miR-367-3pmRNA 表达，抑制miR-367-3p能够逆转葛根素对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用，表明葛根素可能通过下调circ-TLK1表达并上调miR-367-3p表达，从而发挥抗脑卒中的作用。

本研究通过生物信息学软件搜索miR-367-3p的靶基因，并将TLR4 确认为miR-367-3p的直接靶点。miR-497能够通过调节TLR4 和环磷腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-responsive element-binding protein，CREB）信号传导途径减轻患者脑梗死[21]。miR-182-5p通过调节TLR4 介导的炎性反应，在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用[22]。本研究结果显示，模型组TLR4 蛋白表达水平显著降低，葛根素上调TLR4 蛋白表达，过表达TLR4能够逆转葛根素对OGD 致SK-N-SH 细胞损伤的保护作用；此外，circ-TLK1能够通过结合miR-367-3p来调节TLR4 蛋白表达。以上结果表明，葛根素通过circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 轴抑制IS 中的神经细胞损伤。

综上，葛根素能够有效提高IS 体外模型中SK-N-SH 细胞存活率，抑制细胞凋亡，减少炎性因子的分泌，对神经细胞损伤具有保护作用，其作用机制与调控circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突