孕妇VDR基因Fok I位点多态性与脐血25-羟维生素D的关系研究

陈杨萍 徐峰 林蒙蒙 戴晓晓 胡晓霞 张烨

佝偻病是严重影响儿童骨骼发育的疾病之一，大多是由体内维生素D缺乏或不足引起钙、磷代谢紊乱，造成钙盐在骨骼生长的过程中无法正常沉着，从而导致成年后出现骨痛、骨折及骨骼畸形的慢性营养缺乏性疾病。目前研究较多的是胎儿出生后的骨骼发育，较少关注胎儿期的骨骼发育情况。新生儿佝偻病是指在新生儿期发生的钙、磷和（或）维生素D缺乏引起的钙磷代谢失常，造成生长中的骨样组织过多积聚和（或）骨骼基质钙盐沉着障碍的代谢性骨病，有一部分新生儿在出生时就发生，即称为先天性佝偻病，在我国目前并不少见，一旦错失最佳的治疗时机，就会发生不可逆的骨骼畸形。孕母25-羟维生D水平是新生儿体内维生素D储备的主要来源[1]，孕母维生素D不足可引起新生儿骨骼钙化不良、生长发育迟缓及先天性佝偻病[2]。研究表明维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）基因多态性与维生素D缺乏性佝偻病[3]、小鼠子代骨骼发育不良[4]及儿童呼吸系统和内分泌系统疾病[5]的发生相关。Yasovanthi等[6]的研究提示VDR基因Fok I位点与低骨量、骨质疏松及佝偻病有一定的相关性。本研究旨在分析孕妇VDR基因Fok I多态性与脐血25-羟维生素D水平的关系，以期为预防新生儿先天性佝偻病提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年6月至2019年5月在温州市中心医院产检的846例孕妇为研究对象，均为单胎。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有参加本研究的孕妇均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 于孕早期测量孕妇身高、体重、BMI，设计问卷调查表，排除妊娠期糖尿病、高血压病、风湿免疫性疾病、染色体异常、甲状腺异常及骨代谢异常相关疾病。记录孕妇孕期服用钙量及维生素D3、腓肠肌痉挛等情况。研究者查询不同品牌钙补充剂的剂量，根据说明书含量转换为孕期补充维生素D3含量（单位为U）和钙剂含量（单位为 mg），记录新生儿出生时的基本情况。

1.2.2 孕妇VDR基因Fok I多态性及25-羟维生素D水平检测 孕晚期检测孕妇血液中VDR基因Fok I多态性，采用PCR-焦磷酸遗传分析技术。（1）提取：使用长沙三济生物科技有限公司全血DNA基因提取试剂盒提取患者血液中白细胞DNA，置于-20℃保存。（2）扩增：反应体系为25μl，扩增条件为95℃预变性3 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共 45个循环。前引物：5'-GTGGCCTGCTTGCTGTTC-3'，后引物：5'-ACAGATCCGGGGCACGTT-3'， 测 序 引 物 ：5'-TTGCTGTTCTTACAGGG-3'。（3）焦磷酸测序：用 PyroMark Q24 测序仪（德国凯杰公司）随机选择10%样本PCR产物进行焦磷酸基因测序，最后用PyroMark Q24 MDx Software查看测序结果。

1.2.3 25-羟维生素D水平检测 取孕妇孕晚期静脉血5 ml，新生儿出生断脐后抽取脐静脉血3 ml。置于惰性分离胶促凝管及快速血清管，3 000 g离心10 min，将血清标本置于-80℃冰箱保存，并于48 h内检测25-羟维生素D水平。采用美国SHD公司生产的总维生素D测试试剂盒（化学发光法）检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。基因型及等位基因分布频率用Hardy-Weinberg遗传平衡检验[7]。计量资料以表示，多组比较用单因素方差分析。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 为评价基因频率估计的可靠性，对846例孕妇VDR基因Fok I位点的基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果显示其等位基因的位点分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明该组孕妇在温州地区孕妇人群中具有良好的代表性（χ2=1.27，P＞0.05）。

2.2 不同基因型孕妇基本情况比较 846例孕妇中，VDR基因Fok I位点TT基因型206例，占24.35%；TC基因型386例，占45.63%；CC基因型254例，占30.02%。3种不同基因型孕妇年龄、BMI、分娩孕周、服用钙量和维生素D及户外活动时间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 1。

表1 不同基因型孕妇的基本情况比较

2.3 不同基因型孕妇的新生儿出生基本情况比较 3种不同基因型孕妇的新生儿出生体重、性别、分娩方式比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 不同基因型孕妇的新生儿出生基本情况比较

2.4 不同基因型孕妇血清及脐血25-羟维生素D水平、腓肠肌痉挛情况比较 不同基因型孕妇血清及脐血25-羟维生素D水平、腓肠肌痉挛情况比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。两两比较，VDR基因Fok I位点TT型的孕妇血清及脐血25-羟维生素D水平＜TC型＜CC型（均P＜0.05），TT型和TC型均显示25-羟维生素D水平不足；TT型孕妇的腓肠肌痉挛发生率亦较高（均P＜0.05），见表3。

表3 不同基因型孕妇血清及脐血25-羟维生素D浓度、腓肠肌痉挛比较

3 讨论

维生素D是一种脂溶性开环固醇类物质，包括植物来源的维生素D2和动物来源的维生素D3，其在体内经25羟化酶作用下形成25-羟维生素D，再经过1α位羟化成为 1,25（OH）2D3，通过与组织中广泛存在的VDR结合，发挥激素样作用。维生素D主要生理作用是促进钙和磷在肠道中吸收，并抑制甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）释放，维持血钙和磷水平正常，进而保证骨骼正常矿化。有研究报道，维生素D还对代谢、免疫、肿瘤发生、妊娠和胎儿发育等方面也有一定的影响[8]。VDR基因位于染色体12q12-14上，有8个内含子和9个外显子组成。VDR基因编码的维生素D受体蛋白，能特异地结合1,25（OH）2D3，发挥调节软骨细胞增生、分化及成骨细胞、破骨细胞的生物学行为，从而影响骨骼的发育。目前研究发现VDR基因多态性主要有4个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点对骨代谢有重要的影响，分别为Fok I、Bsm I、Apa I及 Taq I限制性酶切位点。Fok I限制性位点多态性位于2号外显子，存在T/C转换多态性，导致编码氨基酸密码子427ACG＞ATG突变，一般以等位基因F、f表示，f表示存在Fok I酶切位点，F表示缺乏Fok I酶切位点，两者可有3种不同的组合（FF、Ff、ff或 CC、TC、TT）。叶侃等[9]的研究表明 Fok I 位点TT型基因型可能是佝偻病的遗传学危险因素。体内维生素D的不足和缺乏可导致非特异性骨骼肌肉痛（non-specific musculosk-eletal pain,NSMP）、骨质疏松、呼吸系统疾病、内分泌疾病及炎症性肠病等。有研究报道，NSMP患者血清中25-羟维生素D大多数缺乏，疼痛程度与其血清25-羟维生素D水平为负相关[10]。25-羟维生素D因其性质稳定，半衰期长，在血清中水平高，故可作为反应体内维生素D营养状况的可靠指标。2016年全球多学科专家共同制定的《全球营养性佝偻病防治共识》中规定维生素D状况：充足为＞50 nmol/L（20 ng/ml）；不足为 30～50 nmol/L（12～20 ng/ml）；缺乏＜30 nmol/L（12 ng/ml）。据针对中国不同纬度城市的相关研究显示，目前我国维生素D的缺乏或不足现象比较普遍[11-13]。维生素D是人体必须的营养物质，通过阳光照射、经口摄入和胎儿母体转运获得。婴幼儿作为一类特殊的群体，早期维生素D的需求主要通过脐带转运来自孕母体内的维生素D。Misra等[14]研究表明孕期维生素D的缺乏可导致新生儿佝偻病。

新生儿佝偻病主要是由于体内维生素D缺乏而引起钙磷代谢异常而导致的生长期骨矿化不全，产生以骨骼病变为特征，同时影响婴幼儿神经、肌肉、免疫功能的全身慢性营养性疾病。有学者研究表明新生儿期的代谢性骨病对儿童以后的身高有重要的远期影响[15]。95%的新生儿先天性佝偻病的原因是母体和新生儿体内钙剂、磷剂和维生素D的相对不足[16]。人类骨骼发育从胎儿期开始，胎儿期的骨骼发育所需80%的钙都是在妊娠最后3个月从母体获得的。孕母体内维生素D的水平和新生儿出生时的胎龄可影响新生儿体内的维生素D水平。1,25（OH）2D3是体内维生素D的主要形式，而胎儿的1,25（OH）2D3完全由母体通过胎盘绒毛膜受血面提供的。因此孕母和新生儿脐血25-羟维生素D水平密切相关，有研究表明孕母体内维生素D缺乏的婴儿、早产或双胎儿出生后其血清维生素D亦不足[17-19]。李雪香等[20]及池美珠等[21]的研究表明新生儿脐血25-羟维生素D水平与孕母外周血25-羟维生素D水平呈正相关，在池美珠的研究中孕母体内合适的维生素D水平不仅可保护胎儿的骨骼发育，还可降低子代精神分裂或双相情感障碍的发生风险。

那么，VDR基因多态性是通过哪种途径影响VDR的功能？有研究表明，VDR基因SNP可能通过影响维生素D受体的mRNA表达，从而导致受体蛋白活性或者数量上不同，进而通过调节基因反式放大作用[22]。另有一种假说提出可能在维生素D基因上有其他未知的多态性位点或在VDR基因所在的第12号染色体上存在其他相关联的基因位点与佝偻病遗传易感性相关，通过与VDR等位基因相连锁进而影响疾病过程[23]。也有学者认为ATG突变为ACG，F位点的VDR蛋白质较f位点短3个氨基酸长度，故与配体亲和力、mRNA的稳定性和转运的活力较f位点高，从而增加肠道对钙的吸收，促进钙磷在骨骼中的沉积[24-25]。本研究中孕妇VDR基因型为TT型者，血清中25-羟维生素D水平最低，对应的脐血25-羟维生素D水平亦最低，TC型次之，提示VDR基因Fok I位点TT型吸收维生素D能力差，进而导致新生儿缺乏25-羟维生素D，有可能造成新生儿先天性佝偻病。笔者建议对孕妇进行VDR基因Fok I位点多态性及血清25-羟维生素D水平的检测，及时个体化补充维生素D，以预防婴幼儿先天性佝偻病的发生。