丙溴磷对映异构体在柑橘中的残留分析及选择性降解

董 超, 李 晶, 杨 秦, 张耀海, 赵其阳, 焦必宁

(西南大学 柑桔研究所，重庆 400712)

在中国生产销售的化学农药中，手性农药所占比例接近40%，且这一比例随着新化合物的不断研发仍在持续增加[1]。手性农药不同对映异构体的活性、毒性及其在生物体和环境中的降解存在显著差异[2-3]，而目前考察手性农药对人类健康和环境安全的影响时，通常没有区分对映异构体差别，导致手性农药风险评估不够准确和全面，进而给人类和环境带来诸多隐患[4]。为此，从对映体水平建立手性农药残留分析方法，研究其在作物及环境中的选择性降解行为规律，是对传统农药残留研究方法的重要补充。

丙溴磷 (profenofos) 是由汽巴-嘉基公司开发的高活性有机磷杀虫剂[5]，因其对柑橘红蜘蛛具有良好的防治效果而在柑橘产业中广泛使用，但其在柑橘中降解缓慢，残留检出率较高，给柑橘水果的食用安全和产业可持续发展造成了较为严重的威胁[6]。而丙溴磷属于手性农药，存在一对对映异构体 (图式1)。

目前，丙溴磷仍以外消旋体形式生产、销售及使用，有关其在柑橘等水果中的残留降解研究已有较多报道[7-9]，但均集中于外消旋体水平。有研究表明：(−)-丙溴磷对于大型蚤Daphnia magna24 h的急性毒性显著大于 (+)-丙溴磷 (EC50分别为0.67和4.38 μg/L)[10]；(−)-丙溴磷对家蝇的毒杀活性也显著高于其对映体 (LD50分别为6 μg/g和23 μg/g)[11]；丙溴磷对映体在土壤中存在选择性降解，其中 (+)-丙溴磷在天津碱性黄土和武汉碱性红土中的降解速率快于 (−)-丙溴磷[12]。因此，有必要从对映体角度研究丙溴磷的环境行为。

鉴于此，本文以丙溴磷为研究对象，在反相模式下优化其对映体分离条件，确定其出峰顺序，结合高效液相色谱-串联质谱技术 (HPLC-MS/MS)，建立了丙溴磷对映体在柑橘中的残留分析方法；进一步通过田间试验，考察并比较了其在柑橘中选择性降解行为的差异。旨在为系统开展手性农药丙溴磷在柑橘上降解的立体选择性行为研究提供数据支持，也为全面开展其在柑橘上降解安全评价研究提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LC-30AD HPLC+AB Qtrap 6500液相色谱-串联质谱检测仪 (美国AB SCIEX公司)；Sigma3-15K台式冷冻离心机 (德国Sigma公司)；CK2000高通量组织研磨仪 (北京托摩根公司)。手性柱Lux Cellulose-1、Lux Amylose-2、Lux Cellulose-3及Lux Cellulose-4购自美国菲罗门公司，手性柱ND(2)-RH、NS(2)-RH及NZ(2)-RH购自广州菲罗门公司，具体参数见表1。

表1 七种商品化的多糖类手性固定相色谱柱Table 1 Seven different kinds of chiral column of polysaccharide-based chiral stationary phases

丙溴磷外消旋体标准品 (纯度99.9%，德国Dr公司)；甲醇和乙腈 (色谱纯，德国Sigma-Aldrich公司)；乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA) 和石墨化炭黑(GCB)(上海安谱科学仪器有限公司)；4种不同内径规格的多壁碳纳米管 (内径为8～10 nm、10～20 nm、20～30 nm和30～50 nm) (中国科学院成都有机化学公司)；有机相针式过滤器 (0.22 μm，上海安谱科学仪器有限公司)。

1.2 残留分析方法

1.2.1 检测条件

色谱条件：采用手性柱ND(2)-RH，柱温35 ℃，流动相V(甲醇) :V(水) = 70 : 30，采用等度洗脱模式，流速0.2 mL/min，进样量2 μL。在该条件下，(+)-丙溴磷和 (−)-丙溴磷的保留时间分别为19.49和22.00 min。

质谱条件：采用电喷雾离子 (ESI) 源，正离子模式。气帘气 (CUR) 137.9 kPa，碰撞器 (CAD)Medium，离子化电压 (IS) 5 500 V，离子源温度500 ℃，喷雾器 (GS1) 344.7 kPa，辅助加热器 (GS2)344.7 kPa。将m/z374.9 ＞ 304.9和374.9 ＞ 347.2分别用于定量和定性分析，质谱参数见表2。

表2 丙溴磷检测的质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of profenofos determination

1.2.2 样品提取与净化 准确称取5.0 g柑橘样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈，垂直振荡5 min后加入2.0 g无水硫酸镁及0.5 g氯化钠垂直振荡1 min，于10 000 r/min下离心5 min。取1.5 mL上清液，加入含有10 mg多壁碳纳米管(内径为10～20 nm) 的2 mL离心管中，涡旋1 min，于4 000 r/min下离心5 min。取上清液，经0.22 μm有机相针式过滤器过滤后待测。

1.2.3 标准溶液的配制及标准曲线绘制 准确称取外消旋丙溴磷标准品10.0 mg于10.0 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 000.0 mg/L的标准储备液，于 –50 ℃避光保存。用乙腈将标准储备液稀释成质量浓度分别为5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000和5 000 μg/L标准工作溶液备用。称取空白样品，按1.2.2节方法进行前处理后获得空白基质液，分别配制质量浓度为5、10、20、50、100、200和500 μg/L的基质标准工作溶液，绘制基质匹配标准曲线。

1.3 田间试验

于2019年9月在西南大学农药残留试验基地，使用50%丙溴磷乳油以有效成分质量浓度为250 mg/L (最高推荐剂量) 的剂量在温州蜜柑上均匀喷雾施药1次。选取4棵生长状态、大小接近的柑橘树设置1个试验小区。在处理小区相邻位置设置1个试验小区，小区间设隔离带。分别于施药后2 h和1、3、5、7、10、15、20、30、40 d采样，每次制全果样品3份。

1.4 数据处理

1.4.1 降解动态分析 通过一级反应动力学方程(1)拟合丙溴磷2个对映体在柑橘中的残留降解动态，通过半衰期 (t1/2) 表示降解速率(2)。

式中：ct代表时间t时分析物的残留量，mg/kg；c0代表施药后分析物的原始沉积量，mg/kg；k代表消解系数；t代表施药后时间，d。

1.4.2 丙溴磷选择性降解评价 采用对映体分数(enantiomer fraction，EF) 来评价丙溴磷在柑橘中的立体选择性降解，按 (3) 式计算。

式中：C+代表 (+)-丙溴磷的残留浓度，C−代表 (−)-丙溴磷的残留浓度。

1.4.3 分离参数计算 容量因子k' = (tn−t0)/t0；分离因子α=kn+1'/kn'；分离度Rs = 2(tn+1−tn)/(wn+1+wn)；其中t0为死时间，tn+1及tn分别为两相邻洗脱峰的保留时间，wn+1及wn分别为两相邻洗脱峰的基线峰宽[13]。

1.4.4 基质效应 基质效应 (matrix effects，Me)是指共流出物影响分析物的离子化效率，使其分析信号增强或减弱的现象。按 (4) 式计算基质效应。

(4)式中：km代表基质匹配标准曲线的斜率，ks代表溶剂标准曲线的斜率。当Me为正值时为基质增强效应，当Me为负值时为基质减弱效应。基质效应在−20%～20%之间为弱基质效应；在−50%～ −20%和20%～50%之间为中等基质效应；超过 −50%或50%为强基质效应[14]。

2 结果与分析

2.1 丙溴磷对映体拆分条件优化

2.1.1 不同手性固定相对丙溴磷对映体分离的影响 在两种流动相组成条件下 [V(甲醇) :V(水) =70 : 30及V(乙腈) :V(水) = 40 : 60]，分别考察了7种不同手性固定相对丙溴磷对映体的拆分性能。结果显示：ND(2)-RH柱 [固定相为直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)] 表现出最佳的拆分性能，在两种流动相组成条件下均可实现丙溴磷对映体的基线分离 (图1)，而其余手性固定相均未能实现该分离。

2.1.2 流动相组成及温度对丙溴磷对映体分离的影响 在确定了最佳固定相后，首先考察了改性剂种类 (甲醇、乙腈) 对于丙溴磷对映体拆分的影响。结果显示，2种改性剂均可实现丙溴磷对映体的基线分离，但甲醇具有更高的洗脱效率，可实现对丙溴磷对映体的快速分析。

其次以甲醇为改性剂，考察了流动相中甲醇所占体积比对丙溴磷拆分的影响。结果 (表3) 表明，随着流动相中甲醇比例的降低，容量因子k值、选择性因子α及分离度Rs逐渐增加，在流动相为V(甲醇) :V(水) = 70 : 30时可实现丙溴磷对映体的基线分离 (Rs = 1.51)。

在确定了最佳流动相组成后，考察了不同柱温对丙溴磷拆分的影响。结果 (表3) 表明，随着柱温升高，容量因子k值呈下降趋势，选择性因子α及分离度Rs逐渐增加。通过比较分离度，在该试验条件下仅有柱温为35 ℃及40 ℃时分离度大于1.5，可实现丙溴磷对映体的基线分离，考虑到手性柱使用寿命 (推荐使用温度小于40 ℃)，选择柱温为35 ℃进行下一步试验。

表3 流动相中甲醇所占体积比和柱温对ND(2)-RH柱上丙溴磷对映体分离的影响Table 3 Effects of volume proportion of methanol in mobile phase and column temperatures on the enantiomeric separation of profenofos on ND(2)-RH column

2.1.3 丙溴磷对映体出峰顺序 为准确确定丙溴磷对映体在ND(2)-RH柱出峰顺序，首先通过分离制备。获得丙溴磷光学纯单体，并通过旋光检测器对其旋光方向进行确认；然后在流动相V(甲醇) :V(水) = 70 : 30、流速0.2 mL/min及柱温35 ℃条件下，经ND(2)-RH柱先后进样检测。如图2所示，在上述条件下，(+)-丙溴磷对映体在ND(2)-RH柱上优先出峰。

2.2 前处理净化条件优化

柑橘样品成分复杂，易产生较强的基质效应，从而显著影响分析的灵敏度。多壁碳纳米管(Carbon nanotubes，MWCNTs) 是1991年Iijima发现的一种新型碳材料，因其独特的纳米中空结构以及比表面积较大而在农药残留检测领域引起高度关注[15]。本文参考Li等[16]方法，综合比较了9种不同组合净化剂对丙溴磷对映体回收率的影响。由图3中可以看出，对于丙溴磷2个对映体而言，分别以100 mg GCB、50 mg GCB和50 mg GCB+50 mg PSA为净化剂，丙溴磷对映体的回收率均小于70%；而以10 mg 4种不同内径规格 (内径分别为8～10 nm、10～20 nm、20～30 nm和30～50 nm) 的多壁碳纳米管、以50 mg PSA及100 mg PSA为净化剂，丙溴磷对映体回收率均大于70%，且内径为10～20 nm的多壁碳纳米管回收率最高，大于80%。通过回收率的比较，最终选择内径为10～20 nm的多壁碳纳米管作为最优净化剂。

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应 从表4可以看出，丙溴磷对映体的基质效应在 −20%～20%之间，在全果中表现出基质减弱效应，在果肉中表现出基质增强效应。由于基质效应不明显，可以采用溶剂标准曲线进行定量分析，但本文为确保结果的准确性，采用基质标准工作液为基准进行了校正。

2.3.2 方法的线性范围和灵敏度 由表4中可以看出：在2.5～250 μg/L线性范围内，丙溴磷对映体的全果及果肉基质匹配标准溶液的峰面积与对应的质量浓度间呈现良好的线性关系，相关系数(r) 为0.999 6～0.999 9。以满足农残分析回收率要求的最低添加水平为方法定量限 (LOQ)，丙溴磷对映体的LOQ为5 μg/kg。

表4 丙溴磷对映体的线性范围Table 4 The linear range of the enantiomers of profenofos

2.3.3 方法的准确度和精密度 取空白柑橘全果及果肉样品进行3个水平 (10、200、1 000 μg/kg) 的添加回收试验 (单一对映体为5、100、500 μg/kg)，每个水平重复5次，按本方法进行测定。由表5可知，丙溴磷对映体的回收率为76%～83%，相对标准偏差 (RSD) 为2.6%～6.0%。方法回收率和精密度良好，适用于柑橘中丙溴磷对映体的分析。

表5 丙溴磷对映体的添加回收率及相对标准偏差Table 5 Recoveries and RSD of profenofos enantiomers

2.4 丙溴磷在柑橘中立体选择性降解评价

在田间试验中发现，丙溴磷对映体在柑橘中的降解规律符合一级反应动力学方程 (图4-A及图4-B)，其降解方程及半衰期见(表6)。通过计算对映体之间的EF值 (图4-C)，发现丙溴磷对映体在柑橘中的EF值均小于0.5，且整体上随着时间呈现下降趋势，在施药后30 d最低，为0.43。表明丙溴磷对映体在柑橘中存在明显的选择性降解，(−)-丙溴磷易产生富集作用。

表6 柑橘全果中丙溴磷对映体的降解方程Table 6 Degradation equations of profenofos enantiomers in the whole fruit of citrus

手性农药在植物中发生选择性降解可能是由于植物中众多酶系的作用[2]，例如脂肪酶是一种广泛存在于植物组织中的水解酶，其对手性化合物2,4-二氯苯氧丙酸甲酯 (2,4-DPM) 的水解具有对映体选择性，优先催化水解S-2,4-DPM[17]。不同种类的作物中含有的酶系种类往往存在差异，可能会使手性农药在作物中表现出不同的选择性结果，例如 (−)-戊唑醇在葡萄中降解快于 (+)-戊唑醇[18]，而 (+)-戊唑醇在草莓中降解快于 (−)-戊唑醇[19]，因此在多种作物中开展选择性降解研究同样具有重要意义。目前关于丙溴磷对映体毒性研究主要集中于急性毒性[11]，而丙溴磷可在非靶标生物的组织中富集[20]，在后续研究中应当开展丙溴磷对映体对于非靶标生物的长期毒性试验，从而为丙溴磷的全面风险评估提供数据支持。

3 结论

本研究建立了丙溴磷对映体在柑橘中的残留分析方法，利用所建立的方法测定了田间试验条件下丙溴磷对映体在柑橘中的降解规律。结果显示，丙溴磷对映体在柑橘中的降解具有选择性，(+)-丙溴磷的降解速率快于 (−)-丙溴磷，从而导致(−)-丙溴磷的相对富集。研究结果可为手性农药对映体的环境行为研究提供基础数据支持。