控制劣变对不同含水量蒙古黄芪种子活力的影响

鲁海坤，于 营，刘亚苓，隋 昕，雷慧霞，郭 靖

（中国农业科学院 特产研究所，吉林 长春 130000）

蒙古黄芪(Astragalus mongholicusBunge)，是豆科黄芪属多年生药用植物，主要分布于山西、河北、内蒙古、黑龙江和吉林等地，其干燥根名为黄芪，是我国传统大宗药材。黄芪性微温味甘，归肺脾经，为补气诸药之最，药用历史悠久且价值高，近年来黄芪的开发利用越来越受到国内外重视，野生资源已不能满足市场需求，商品黄芪主要来源于人工栽培。蒙古黄芪种子不仅是繁殖材料，也是种质资源遗传载体，因此为保证黄芪产业可持续发展，研究其种子活力丧失机理和适宜贮藏条件尤为重要。

由于在自然条件下难以在短时间内获得不同活力批次的种子，故提出人工加速老化方法［1］。许多报道表明，人工加速老化可以模拟自然老化，两者老化机理没有差异［2-3］。人工加速老化试验是采用高温高湿条件使种子快速丧失活力的方法，控制劣变与人工加速老化原理相似，但是可以控制种子含水量。而含水量可以影响种子内部氧化反应，从而进一步影响种子活力水平，是影响种子贮藏寿命的关键因素。本试验通过控制劣变的方法研究不同含水量蒙古黄芪种子劣变过程中种子发芽指标、生理生化指标的变化，旨在分析引起种子活力下降与其生理生化特性的变化关系，揭示蒙古黄芪种子劣变的机理，为蒙古黄芪种子常规贮藏及低温种质库贮藏供理论、技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究的种子购于河北安国，经中国农业科学院特产所郭靖研究员鉴定为蒙古黄芪(Artragalus mongholicus)种子。种子初始含水量为9.8%，发芽率为89%。将种子置于硅胶干燥器中进行干燥处理，得到含水量为3.7%、6.6%和9.8%的种子，将3种含水量的种子用铝箔袋密封包装备用。

1.2 试验方法

1.2.1 控制劣变处理 将不同含水量种子置于(53±0.5) ℃恒 温 水 浴 锅 中 人 工 劣 变0、3、6、12 d得到不同活力水平的种子，试验前种子贮藏于4 ℃冰箱。

1.2.2 种子回湿处理 采用逐级回湿的方法，20 ℃条件下，将装有含水量3.7%种子的尼龙网袋依次放入盛有饱和氯化钙溶液(35% RH)、饱和氯化铵溶液(70% RH)和水(100% RH)的干燥器中，各自平衡24 h ，后进行发芽测定。

1.2.3 种子发芽指标测定 种子发芽率测定参照ISTA的方法进行［4］，挑选籽粒饱满、大小均一的黄芪种子，采用滤纸发芽床，将两层滤纸置于直径9 cm的培养皿内，每皿100粒，3次重复。置于光照培养箱内发芽，温度和光照控制为15/25 ℃ 〔高温8 h，低温16 h，高温时光照（36 mmol/m2·s），低温时黑暗〕。逐日检查发芽种子数，第7天统计发芽率、发芽指数。

发芽率(%)=(终发芽种子数/供试种子数)×100

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt为t日发芽数，Dt为相应天数

1.2.4 生理生化指标测定 活性氧含量测定使用北京索莱宝科技有限公司生产的试剂盒，超氧化物歧化酶（SOD） 、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定参考宋松泉［5］的方法进行，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量测定参考高俊凤［6］的方法进行。1.2.5 数据处理 采用Microsoft Office Excel 2016进行数据计算和作图，使用SPSS 17.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 控制劣变对蒙古黄芪种子发芽指标的影响

由图1可知，劣变处理前不同含水量种子之间发芽率和发芽指数无显著差异。在劣变3～6 d时，含水量3.7%和6.6%的种子发芽率无显著差异且都显著高于9.8%的种子（P＜0.05），劣变12 d时不同含水量种子之间发芽率差异显著（P＜0.05）。而在劣变3～12 d 期间，不同含水量种子之间发芽指数均有显著差异（P＜0.05）。

图1 控制劣变对不同含水量蒙古黄芪种子发芽率的影响Fig. 1 Effect of CDT on the germination rate of A.mongholicus seeds with different water content

随着劣变时间延长，不同含水量的蒙古黄芪种子发芽率和发芽指数均呈现下降趋势，且随种子含水量升高，发芽指标下降幅度增大。种子发芽指标大幅下降说明劣变明显影响了种子活力，使种子萌发能力减弱。而含水量3.7%的种子相对于含水量6.6%和9.8%的种子，其发芽速度更快更整齐，说明低含水量种子抵御高温刺激的能力更强。

2.2 控制劣变对蒙古黄芪种子活性氧积累的影响

超氧阴离子是大部分ROS的前体，积累过多会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体代谢异常。由图2A可以看出，随着劣变时间延长，超氧阴离子产生速率总体呈现上升趋势。劣变0和6 d时，各含水量种子的超氧阴离子产生速率无显著差异；劣变3 d时，含水量3.7%和6.6%种子的超氧阴离子产生速率无显著差异，且均显著低于含水量9.8%的种子；劣变12 d时，含水量6.6%和9.8%的种子的超氧阴离子产生速率无显著差异，且显著高于含水量3.7%的种子（P＜0.05）。

图2 控制劣变对不同含水量蒙古黄芪种子O2-产生速率和H2O2含量的影响Fig. 2 Effects of CDT on O2- production rate and H2O2 content of A.mongholicus seeds with different water content

H2O2是生物体内最常见的活性氧分子，可以使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体，同时它也是氧化应激反应中的调节因子。如图2B所示，蒙古黄芪种子内H2O2含量随劣变时间进行整体呈上升趋势。劣变0 d时，各含水量种子H2O2含量无显著差异；劣变3 d时，含水量9.8%的种子H2O2含量显著高于含水量3.7%（P＜0.05），含水量6.6%的种子居中；劣变6～12 d时，不同含水量的种子H2O2含量均有显著差异（P＜0.05），且随含水量升高而升高。

氧气在生物体内代谢过程中会产生一些活泼的物质如超氧阴离子（O2-）、氢氧根离子（OH-）羟自由基(·OH)、过氧化氢（H2O2）、单线态氧(1O2·)等，它们统称为活性氧，且氧化能力较强。植物细胞内的多种细胞器或者部位都可以产生活性氧，且在正常生命活动中活性氧产生和消除处于动态平衡状态，而当植物受生物或非生物胁迫时，其体内活性氧（ROS）产生和清除机制会失去平衡，氧胁迫改变植物代谢、生长及发育的进程，使细胞功能发生紊乱甚至丧失，最终导致细胞死亡。对于种子而言，积累过多的活性氧产生膜脂过氧化，降低膜完整性，表现为种子活力降低。含水量3.7%的种子可能由于种子内自由水含量低，代谢微弱，产生的活性氧相对于6.6%和9.8%的种子较少，这有助于延缓种子衰老。

2.3 控制劣变对蒙古黄芪种子抗氧化酶活性的影响

如图3A所示，SOD活性在劣变0～3 d迅速上升，之后的劣变过程中保持稳定。在劣变0 d，不同含水量蒙古黄芪种子SOD活性均有显著差异（P＜0.05），且SOD活性随含水量升高而升高；劣变3和6 d时，含水量6.6%的种子SOD活性最高，含水量3.7%的种子SOD活性居中，含水量9.8%的种子SOD活性最低；劣变12 d时，各含水量种子SOD活性无显著差异。如图3B所示，APX活性变化与含水量有关，含水量3.7%和6.6%的种子APX活性先升高再降低，含水量9.8%的种子APX活性随劣变时间延长呈现逐渐降低趋势。劣变0 d，含水量6.6%和9.8%的种子APX活性无差异且显著低于含水量6.6%的种子；劣变3 d时APX活性随含水量升高降低；劣变6 d时，含水量3.7%和6.6%无显著差异，且显著高于含水量9.8%的种子（P＜0.05）；劣变12 d，APX活性随含水量升高而显著降低（P＜0.05）。如图3C所示，DHAR活性变化与含水量有关，含水量3.7%和6.6%的蒙古黄芪种子DHAR活性先升高再降低，含水量9.8%的种子DHAR活性随劣变时间延长呈现逐渐降低趋势。劣变0 d时，各含水量的种子之间DHAR活性无显著差异；劣变3 d时，含水量3.7%和6.6%的种子DHAR活性无显著差异（P＞0.05），且均显著高于含水量9.8%的种子（P＜0.05）；劣变6和12 d时，不同含水量的种子DHAR活性有显著差异（P＜0.05），随含水量升高而降低。如图3D所示，MDHAR活性随劣变时间延长呈现先升高后降低的趋势，且在劣变过程中酶活性随种子含水量升高而降低。在劣变0 d时，各含水量种子之间酶活性无显著差异；劣变3 d时，含水量6.6%和9.8%的种子酶活性无显著差异，且显著低于含水量3.7%的种子（P＜0.05）；劣变6 d时，含水量3.7%的种子酶活性显著高于9.8%的种子（P＜0.05），含水量6.6%的种子酶活性居中；劣变12 d，不同含水量的种子酶活性有显著差异（P＜0.05），且酶活性随含水量升高而降低。

图3 控制劣变对不同含水量蒙古黄芪种子抗氧化酶活性的影响Fig. 3 The effect of CDT on the antioxidant enzyme activity of A.mongholicus seeds with different water content

如图3E所示，GR活性随劣变时间延长总体呈现先升高后降低的趋势。在劣变0和3 d时，含水量6.6%和9.8%的种子GR活性无显著差异，且显著高于含水量3.7%的种子（P＜0.05）；在劣变6 d时，含水量3.7%和6.6%的种子酶活性无显著差异，且显著高于含水量9.8%的种子（P＜0.05）；劣变12 d时，不同含水量的种子酶活性均有显著差异，且酶活性随含水量升高而降低。

SOD活性随劣变进行其活力不断升高，表明在高温环境刺激下，种子内的抗氧化酶系统产生了一定的应激反应来清除机体产生的活性氧。APX、DHAR、MDHAR、GR等4种酶有先升高后降低的趋势，表明在劣变初期，这些酶在种子内发挥清除活性氧的作用，而当种子劣变程度加剧的时候，酶活性受到抑制，清除活性氧能力降低，使得活性氧进一步积累。种子抗氧化酶活性的变化与含水量密切相关，含水量3.7%的种子在劣变过程中，其5种抗氧化酶活性整体高于含水量6.6和9.8%的种子，表明其抗逆能力更强，活力更高，

2.4 控制劣变对蒙古黄芪种子MDA含量的影响

如图4所示，随着劣变时间的进行，不同含水量的蒙古黄芪种子MDA含量都呈现逐渐升高的趋势。劣变0 d时，含水量6.6%的种子MDA含量显著高于含水量9.8%的种子（P＜0.05），含水量3.7%的种子含量居中；劣变3、6和12 d时，含水量6.6%和9.8%的种子MDA含量无显著差异，且均显著高于含水量3.7%的种子。

图4 控制劣变对不同含水量蒙古黄芪种子MDA含量的影响Fig. 4 The effect of CDT on the MDA content of A.mongholicus seeds with different water content

种子在劣变过程中不断产生活性氧，攻击生物膜上的不饱和脂肪酸产生过氧化反应。随种子劣变程度加深，活性氧平衡遭到破坏，过剩的氧自由基加剧膜脂过氧化作用产生有毒害的醛类物质如丙二醛（MDA），造成膜系统损伤，加速种子衰老死亡。含水量3.7%的种子在劣变过程中积累的MDA量明显少于含水量6.6%和9.8%的种子，表示低含水量的种子膜脂过氧化程度较轻，所受毒害作用较小。

2.5 人工劣变对蒙古黄芪种子贮藏物质的影响

如图5A所示，不同含水量蒙古黄芪种子在劣变过程中可溶性糖含量变化趋势不一致，含水量3.7%和9.8%的种子可溶性糖含量随劣变时间延长先升高后降低，含水量6.6%的种子在劣变过程中可溶性糖含量先下降后升高再降低。在劣变0 d时，含水量3.7%的种子可溶性糖含量显著高于含水量9.8%的种子（P＜0.05），含水量6.6%的种子居中；劣变3 d时，含水量6.6%和9.8%的种子可溶性糖含量无显著差异，且显著低于含水量3.7%的种子（P＜0.05）；劣变6 d时，不同含水量的种子可溶性糖含量均有显著差异（P＜0.05），可溶性糖含量从高到低依次为含水量6.6%，3.7%，9.8%的种子；劣变12 d时，含水量3.7%和6.6%的种子可溶性糖含量无显著差异，且均显著高于含水量9.8%的种子（P＜0.05）。

如图5B所示，随着劣变时间的延长，蒙古黄芪种子可溶性蛋白含量总体呈下降趋势。在劣变0和6 d时，不同含水量的种子可溶性蛋白含量无显著差异；劣变3 d时，含水量6.6%和9.8%的种子可溶性蛋白无显著差异，且均显著低于含水量3.7%的种子（P＜0.05）；劣变12 d时，含水量3.7%的种子可溶性蛋白含量显著高于含水量9.8%的种子，二者与含水量6.6%的种子无显著差异。

图5 控制劣变对不同含水量蒙古黄芪种子贮藏物质含量的影响Fig. 5 The effect of CDT on the content of storage substance of A.mongholicus seeds with different water content

种子中有着丰富的贮藏物质，如蛋白质、碳水化合物，脂质等 ，在种子衰老过程中这些贮藏物质含量会发生变化。可溶性糖和蛋白质分别作为呼吸底物和氮源，为种子萌发提供必需条件，多数研究表明随着种子老化其含量下降。且贮藏物质下降幅度与含水量有关，与含水量3.7%和6.6%的种子相比，含水量9.8%的种子其可溶性糖和可溶性蛋白含量下降较多，可能是由于含水量高的种子其体内过氧化作用较强，贮藏物质降解速度较快。

3 讨论与结论

种子活力的丧失主要受贮藏环境的湿度和温度这两大因素的影响，所以种子含水量的高低对于种子贮藏来说至关重要。有研究表明，种子含水量在5%～14%范围内每降低1%，种子寿命延长1倍［7］。本试验通过人工劣变研究不同含水量的蒙古黄芪种子劣变过程中活力丧失的特性发现，随着劣变时间的延长，不同含水量种子发芽率均逐渐降低，且种子发芽率与含水量呈负相关关系。种子劣变在微观上是一个渐变且复杂的生理生化过程，被普遍认可的种子衰老的“自由基学说”认为种子内会不断产生活性氧造成细胞成分的氧化降解，最终导致种子死亡［8］。活性氧（ROS）包括超氧阴离子、羟自由基、单线态氧和过氧化氢等，参与种子生长发育的整个过程，一般认为活性氧是植物受胁迫时产生的有害代谢物，会损害细胞结构和功能［9-10］。Pukacka［11］的研究表明活性氧和种子活力密切相关，活性氧含量会随时间积累，且在高温高湿条件下加速这个累积过程。本试验结果表明，蒙古黄芪种子在劣变过程中超氧阴离子产生速率随劣变时间延长整体呈不断上升趋势，与方娇阳［12］在香椿种子老化研究中结果一致，且含水量高的种子超氧阴离子产生速率增幅更大。

植物种子内含有SOD和AsA-GSH循环酶（APX、DHAR、MDHAR、GR）等抗氧化酶，抗氧化酶活性与种子自身代谢及逆境胁迫有密切关系，这些酶可以清除种子内的活性氧，构成抵御氧化逆境的屏障，维持细胞内活性氧的平衡。SOD是清除活性氧的第一道防线，它可以将超氧阴离子歧化为过氧化氢。在劣变0～3 d，超氧阴离子产生速率增加引起SOD活性迅速上升，在劣变后期由于超氧阴离子的不断积累，SOD活性也保持较高水平，这与大多数关于种子劣变后SOD活性下降的研究结果不一致［13-15］，但与吴聚兰［16］在大豆劣变研究中结果趋势一致。

在AsA-GSH循环中APX催化H2O2与ASA反应生成H2O和MDHA，MDHA一部分被MDHAR还原为AsA，另一部分被歧化生成DHA，再被DHAR还原为AsA，以此清除种子细胞内H2O2，GR使大部分谷胱甘肽处于还原状态，为活性氧清除提供还原力［17］。本试验中劣变0～3 d时，含水量为3.7%和6.6%的种子中APX、DHAR、MDHAR、GR活性提高，一定程度上清除了H2O2，其含量只有小幅提高；而含水量9.8%的种子APX活性下降，H2O2清除能力下降导致H2O2积累较多，进而使膜脂过氧化程度增高导致其发芽率低于含水量3.7%的种子。劣变6～12 d时，抗氧化酶（APX、DHAR、MDHAR、GR）活性不断下降，ROS（O2-和H2O2）逐渐积累，攻击核酸和蛋白质等生物大分子，同时膜脂过氧化程度加剧，细胞遭受损害，表现为可溶性蛋白质和可溶性糖含量下降［18］，MDA含量不断上升，种子活力快速丧失，与夏方山［19］在燕麦劣变研究中类似。

含水量与种子劣变速度联系密切，本试验中相比高含水量种子，低含水量的种子在劣变过程中活性氧含量较低，抗氧化酶活性较高，MDA含量较低，可溶性蛋白含量较高，表现出更强的抗氧化应激能力而使种子活力更强、发芽率更高。分析这种现象可能是与种子生理代谢活动强弱相关，含水量高的种子生理代谢活动强，在高温条件下劣变快，含水量低的种子生理代谢活动弱，劣变速度慢［20］。且当种子含水量低于5%时，种子水合程度极低，组织的物理状态黏性高呈“玻璃态”，当细胞成分处于“玻璃态”时，限制了分子的流动，这种惰性的相对稳定的玻璃化状态能极大的减慢有害化学反应的速率，延长干燥种子的寿命［21］。

综上所述，可以得出：(1)随着劣变时间延长，不同含水量种子的发芽率和发芽指数均呈下降趋势，且与含水量呈负相关关系。(2)随着劣变时间延长，不同含水量种子的活性氧含量均呈上升趋势，抗氧化酶除 SOD 活性升高外，APX、DHAR、MDHAR，GR活性均整体呈下降趋势。MDA含量随劣变时间呈上升趋势，可溶性糖和可溶性蛋白含量呈下降趋势。(3)低含水量黄芪种子抗氧化能力和抵御外界刺激能力高于高含水量黄芪种子，因此超干含水量3.7%比6.6%和9.8%更适宜黄芪种子贮藏。