基于拉曼光谱方法研究不同剪切力下的红细胞亚损伤

王金爽， 付莹莹， 符珉瑞， 高 斌*， 郑大威， 常 宇

1. 北京工业大学环境与生命学部， 北京 100124 2. 浙江大学医学院附属儿童医院国家儿童健康与疾病临床医学研究中心， 浙江 杭州 310003

引 言

血液损伤状况是评价人工心脏泵设计是否可用的一个重要指标， 血细胞在人工心脏泵叶轮转动过程中产生的剪切应力的作用下受到损伤， 导致其耐受性降低、 寿命下降[1-3]。 当细胞受损伤达到细胞可承受的阈值后， 红细胞破裂， 细胞内部的血红蛋白外泄， 即发生溶血。 目前评价血液损伤仍然采用测量游离血红蛋白的方法， 只考虑完全破裂的红细胞。 而事实上完全破裂产生溶血的红细胞只占一小部分， 未破裂的红细胞被发现也受到了不同程度的不可逆损伤， 这种现象被称作红细胞的亚损伤[4]。 Horobin[5]、 Michael[6]研究发现红细胞暴露在超生理的剪应力下(50 pa以上)时， 虽然未破裂但其形变能力已经受损。 因此在评价血液损伤时需要关注红细胞亚损伤状况， 对于红细胞亚损伤还需要更多的研究。

目前也有一些学者从不同角度对红细胞亚损伤情况进行了研究， 例如， 设置机械敏感性指数以确定亚溶血阈值[7]； 通过红细胞机械脆性、 血浆游离血红蛋白等多种参数综合来评价血液损伤[8]。 但现有的研究存在计算困难， 方法复杂等问题。

拉曼检测技术可实现快速、 无损、 定量的检测， 其光谱具备指纹光谱特征能够真实的反映物质的内部分子结构信息， 在评估细胞的结构与功能的损伤方面得到了广泛的应用[9]。 但是能否用于评估红细胞的亚损伤尚不清楚。 因此本文开展体外血液剪切应力实验， 验证拉曼光谱对红细胞亚损伤程度的评估能力。

本研究将拉曼光谱技术应用到人工心脏泵领域可以更加细致的分析人工心脏泵磨损后的血液亚损伤状况。 利用共聚焦拉曼仪器， 测量了0， 50， 100， 150， 200， 250和300 pa剪切应力作用下的红细胞拉曼谱图， 通过对比红细胞的拉曼谱图变化， 评估红细胞亚损伤的程度， 为建立更加全面的人工心脏泵血液损伤评价体系提供参考。

1 实验部分

inVia共聚焦显微拉曼光谱仪(Renishaw公司)， TG-16WS高速离心机(湖南湘仪离心机有限公司)， 血液剪切力试验平台(课题组搭建)； 实验用猪血(北京实创世纪小型猪养殖基地)， Amresco 血红蛋白标样(北京迈瑞达科技有限公司)， HyClone 磷酸盐缓冲溶液( PH7.4)(北京迈瑞达科技有限公司)。

血液剪切力试验平台[10]主要由微控注射泵、 联通管路和剪切力模拟装置组成。 剪切力模拟装置内部为圆柱形转子， 外部为同轴心的筒型圆柱定子， 试样从转子和定子之间0.1 mm的缝隙内流过， 通过调节转子的转动速度对试样施加不同大小的剪切力。 本实验中， 通过试验平台分别对测试血样施加暴露时间(微控注射泵控制试样流过剪切模拟装置的时间)为1 s， 大小分别为0， 50， 100， 150， 200， 250和300 pa的剪切力。

红细胞悬液配制： 将1.5 mL磨损后的血液样本以1 600 r·min-1离心5 min； 去除上层清液后加入3倍以上体积的PBS， 用移液枪吹散细胞(重复以上步骤， 洗涤红细胞3次)； 取出50 μL的下层红细胞， 用PBS稀释至5 mL后混匀备用。 血红蛋白溶液(稀释法)配制： 称取血红蛋白粉末后， 将血红蛋白粉末用超纯水进行溶解， 配置成100 mg·L-1浓度的血红蛋白溶液。 血红蛋白溶液(溶胀法)配制： 取150 μL的底层红细胞， 加超纯水稀释至1.5 mL， 以15 000 r·min-1离心35 min， 上层清透溶液即为血红蛋白溶液。

实验采用100倍长焦物镜， 532 nm激光光源波长， 积分时间为10 s， 积分次数为2次， 测量功率2.5 mW， 扫描范围500～1 800 cm-1。 取样本溶液10 μL滴至载玻片， 置于共聚焦拉曼显微镜载物台上直接测量， 对每一样本溶液进行不少于20次的采集。 实验用WIRE4.0对测量后的原始谱图进行基线校正、 平滑降噪的预处理。 Origin8.0对谱图归一化处理后取平均值， 根据红细胞的拉曼谱图对比， 评估红细胞亚损伤的程度， 运用曲线拟合方法对剪切应力下红细胞的特征峰进行拟合， 验证拉曼光谱对红细胞亚损伤程度的评估能力。

2 结果与讨论

2.1 红细胞与血红蛋白标准谱图及特征峰

实验测定了相同条件下红细胞与血红蛋白的标准谱图， 对比如图1所示， 其中血红蛋白溶液(稀释法)要比直接测量血红蛋白粉末测得的峰位置信息更加丰富。 测量红细胞谱图与血红蛋白溶液(溶胀法)测得的游离血红蛋白峰位置、 峰强几乎一致， 且比血红蛋白溶液(稀释法)和血红蛋白粉末的峰位置信息更加精细、 丰富、 精确度高， 表现为1 549和1 604 cm-1两位置的特征峰。 图1中所标注的峰位置皆为血红蛋白特征峰， 峰的归属列出如表1所示。 1 549 cm-1峰位置归属与1 562 cm-1一致， 1 604 cm-1峰位置归属与1 586 cm-1一致。 对红细胞悬液样本在同样的采集条件下重复采集， 经预处理后的谱图如图2所示， 红细胞特征峰表现稳定。 红细胞谱图能够反映血红蛋白的内部结构， 且以本方法采集红细胞谱图方法正确、 重复性好。

图1 红细胞和血红蛋白拉曼标准谱图对比

图2 红细胞悬液拉曼谱图重复采集结果

表1 532 nm红细胞谱图特征峰归属表[11-14]

2.2 共聚焦显微拉曼测定不同剪切力下的红细胞

2.2.1 不同剪切力红细胞谱图对比与分析

由图3看出， 相同批次的血液样本， 测量游离血红蛋白吸光度为0.066， 对不同剪切力作用下红细胞悬液样本采集的谱图有明显差异。 1 280～1 680 cm-1区间放大如图4所示， 随着剪切力的增大， 1 376 cm-1峰位置左侧明显抬高， 1 549和1 604 cm-1峰的强度升高， 1 639 cm-1峰的强下降。 1 300～1 500 cm-1的谱带强度主要由吡咯环呼吸振动引起， 尤其1 376 cm-1峰位置对氧化态敏感， 此处的降低标志着血红素凝集[14]， 由左侧的抬高可以看出血红蛋白的内部结构发生了变化。 1 500～1 600 cm-1为亚铁离子高自旋标记带， 1 549和1 604 cm-1峰的强度升高， 亚铁离子脱氧高自旋[11]， 血红蛋白向去氧态发展， 难以与氧结合。 1 638 cm-1位置为氧浓度的标记带， 表征α螺旋结构[12]， 且对卟啉环氧化作用敏感， 此处减小说明α链合成减弱， 血红蛋白不易与氧结合。

图3 不同剪切力下红细胞拉曼谱图对比

图4 1 280～1 680 cm-1不同剪切力下红细胞拉曼谱图对比

2.2.2 不同剪切力红细胞谱图的统计学分析

在测量功率2.5 mW、 积分时间10 s、 积分次数2次的条件下对每一溶液样本进行20次的测量采集， 经对比发现不同剪切力的作用下， 1 549 cm-1位置的ν11亚铁离子高自旋振动标记带的峰强差异最明显。 图5给出了不同剪切力下1 549 cm-1位置峰强的散点图， 说明不同剪切力下亚损伤红细胞的谱图采集稳定性较好， 误差较小。 剔除个别离散点后取平均， 对不同剪切应力下1 549 cm-1位置峰强进行拟合， 拟合发现线性拟合效果最好， 结果如图6所示， 在1 549 cm-1位置， 剪切力大小与拉曼峰强之间呈现良好的线性关系。

图5 1 549 cm-1位置不同剪切应力的散点图

图6 不同剪切应力与1 549 cm-1位置峰强拟合结果

2.3 重复性实验验证与分析

对不同批次的血液， 测量游离血红蛋白吸光度为0.110， 进行了不同剪切力下红细胞的拉曼谱图采集的重复性实验， 检测结果如图7所示， 随着剪切应力的增大， 除了1 376 cm-1峰位置左侧明显抬高， 1 549和1 604 cm-1位置峰强升高， 1 638 cm-1位置峰强下降以外， 在998和1 173 cm-1位置， 峰强也有增高的趋势。 同样对1 549 cm-1位置的峰强进行拟合， 拟合结果如图8所示， 说明在1 549 cm-1位置， 剪切力大小与拉曼强度之间呈现良好的线性关系。

图7 重复实验中不同剪切力下红细胞拉曼谱图对比

图8 重复实验中不同剪切应力与1 549 cm-1 位置峰强的线性拟合

对比两组实验结果， 可以看出虽然1 549 cm-1峰的强度与剪切应力之间都呈现良好的线性关系， 且误差小区分明显， 但两次实验的拟合曲线k值有所差别。 倒置显微镜下观察两组血液样本的红细胞形态大部分完好， 几乎无差别， 经过分光光度法测量， 两批血样的游离血红蛋白含量不同。 猜测拟合曲线的k值的不同可能是由于不同批次的血液样本质量、 红细胞的耐受程度不同导致的， 这部分后续将做深入探究。 所以利用拉曼光谱法不仅可以简单的区分不同剪切力条件下的血样， 也可以很好的评价血液样本的质量， 尤其是在分光光度计测量溶血指标变化不大、 光镜观察红细胞形态几乎无差别的情况下， 拉曼则有可能检测到红细胞内部结构更细微的变化， 可以更精确的鉴定红细胞的损伤程度。

另外， 根据对红细胞与血红蛋白标谱的对比结果， 红细胞谱图能够反映血红蛋白的内部结构， 不同剪切力的作用下， 红细胞的拉曼谱图变化体现其血红蛋白内部结构发生了变化， 说明剪切力可以透过细胞膜对红细胞内血红蛋白产生影响。 在细胞膜未破裂的情况下， 剪切力的作用会导致处于1 639 cm-1位置的氧浓度标记带减弱， 这与G. Rusciano[13]的研究结果是一致的。 1 549和1 604 cm-1处的吸收峰峰强升高， 亚铁离子脱氧高自旋， 导致血红素与吡咯环之间的距离减小， 红细胞直径减小[4]。 考虑可能存在胞浆的流出导致血红蛋白浓度相对增加[4, 15]， 细胞内粘度增加， 使得细胞直径的减小， 从而影响到血红蛋白的内部结构。 但具体剪切应力是如何透过细胞膜而影响到其内部血红蛋白结构的机制还有待探讨。

3 结 论

实验测定不同剪切力下红细胞的拉曼谱图， 结果显示1 376 cm-1峰位置左侧谱线明显抬高， 1 549和1 604 cm-1位置峰强随着剪切力的增大升高， 1 639 cm-1位置峰强则减弱。 其中1 549 cm-1位置峰强为亚铁离子高自旋带， 与β链螺旋结构有关， 在不同剪切力的作用下， 峰强差异表现最明显。 经曲线拟合， 发现此位置红细胞的峰强与剪切应力呈明显的正向线性关系， 线性拟合效果良好。 经过重复性实验验证， 证明该方法且具有较好的重现性。 另外根据不同剪切力作用导致红细胞拉曼谱图的变化， 而红细胞谱图能够反映血红蛋白的内部结构， 说明剪切应力可以透过细胞膜而影响到其内部血红蛋白结构。 利用拉曼技术可以准确、 快速的区分在不同剪切应力下受到不同程度损伤的红细胞， 并能根据谱图推论分析细胞内部结构的变化， 样本处理简单、 耗时短、 操作简便。 未来可以尝试定量分析， 建立更加全面的红细胞损伤评价体系， 进一步拓宽拉曼检测方法在人工心脏泵血液损伤评价方面的应用。