CDK4及CD133在骨肉瘤组织中的表达及临床意义

崔松体 左坦坦 李照义

骨肉瘤是一种好发于儿童和青少年的骨科恶性肿瘤，总体发病率约为4.4/10万人，近年来发病率呈增加状态。骨肉瘤的发病与长骨干的第二生长高峰期密切相关，其中股骨远端、胫骨和肱骨近端较为多见[1-3]。近年来随着化疗技术的不断进步，骨肉瘤患者预后有了很大的改善，但由于骨肉瘤组织易发生转移进而侵袭其它脏器，对患者预后产生不良影响，因此通过对其免疫机制进行研究，发掘新兴靶点，对于疾病的诊断、治疗及预后具有重要的意义[4-5]。细胞周期数依赖性蛋白激酶(cell cycle number dependent protein kinase，CDKs)是机体细胞周期调控的关键因子，研究发现其家族成员CDK4、CDK6对于多种恶性肿瘤的病情判断及预后具有指示价值，美国FDA已批准将CDK4/6用于转移性乳腺癌的临床治疗[5-6]。CD133是近年来发现的细胞表面标志物，通过作用于多种细胞如小肠干细胞、人肾上皮细胞、结直肠癌、前列腺癌等组织细胞发挥生物标志物功能[7-8]。在骨肉瘤组织中CDK4、CD133表达改变及其临床价值尚不明确，本研究对本院收治的骨肉瘤患者组织中CDK4、CD133表达进行探讨，旨在为其免疫学机制研究及靶向药物开发提供有价值的研究基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集本院骨科2013年3月至2015年3月进行手术的骨肉瘤患者87例，在术中收集其病灶标本，保存于液氮中备用。纳入标准：①均经术中病理证实为骨肉瘤。②术前未接受放、化疗或免疫治疗。③临床资料完整。排除标准：①合并其它恶性肿瘤。②治疗中途转院。③对研究不配合。87例骨肉瘤患者中男性56例，女性31例；年龄7～49岁，平均(21.98±7.94)岁；发病部位：股骨41例，胫骨32例，肱骨14例；Enneking外科分期Ⅰ期28例，Ⅱ期32例，Ⅲ期27例；组织学类型普通型51例、毛细血管扩张型19例，小细胞型17例；按是否转移：有肺转移28例，无肺转移59例。选择同期医院骨科进行手术的骨软骨瘤手术切除标本作为对照，对照组包括男性28例，女性12例，年龄11～42岁，平均(23.36±6.75)岁。2组性别、年龄比较无差异(P>0.05)。本研究征得医院伦理委员会审核通过。

1.2 免疫组化检测

采用免疫组化SP法检测2组患者病灶组织中CDK4、CD133蛋白表达情况，具体步骤：将石蜡包埋的组织进行4 μm切片，切片浸泡于PH 8.0的EDTA溶液中，微波抗原修复10 min，冷却至室温后充分将其水洗，并用PBS进行浸洗，加入山羊血清封闭液孵育20 min，去除多余的液体。滴加CDK4、CD133单抗后4 ℃过夜孵育，PBS洗后加入具有生物标记的二抗37 ℃孵育30 min，采用DAB试剂盒进行显色，并以苏木精染色，中性树胶封片后镜检结果。由经验丰富的病理科医师进行双盲评阅，以胞核或胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，采用半定量法计算其阳性率。

1.3 随访

所有患者均在术后复查时或电话进行随访，随访间隔为3个月，总生存时间(OS)：自术后出院第1天开始，至患者死亡或随访截止时间，随访截至时间为2020年5月1日。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 2组组织中CDK4、CD133表达阳性率比较

研究组病灶组织中CDK4、CD133蛋白表达阳性率高于对照组(P>0.05)，见表1。

表1 2组组织中CDK4、CD133阳性表达比较(例，%)

2.2 骨肉瘤组织CDK4、CD133表达与临床病理参数的关系

骨肉瘤组织CDK4、CD133表达与外科分期、是否转移有关(P<0.05)，与性别、年龄、发病部位及组织学类型无关(P>0.05)，见表2。

表2 骨肉瘤组织CDK4、CD133表达与临床病理参数的关系/例

2.3 骨肉瘤组织CDK4、CD133表达与患者预后的关系

Logrank分析结果显示，骨肉瘤组织CDK4、CD133阳性表达表达患者OS分别为26.0月、28.0月，低于CDK4、CD133阴性骨肉瘤患者OS的36.0个月、39.0个月(P<0.05)，见图1。

图1 骨肉瘤组织CDK4、CD133表达与患者预后的关系

3 讨论

骨肉瘤是以危害青少年及儿童为主、异质性高的恶性肿瘤，因其在诊断时20%已处于晚期阶段或发生肺转移，临床死亡率较高[9-10]。骨肉瘤在临床上分型较多，治疗相对棘手，近年来以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫靶向治疗在多种恶性肿瘤治疗中取得了较好的进展，但由于骨肉瘤机制研究尚少[11-12]，相关靶点发掘不足，因此临床中可用于该病的治疗药物相对较少，通过发掘可靠的生物标志物对该病的免疫机制进行了解，对于指导患者个体化治疗，改善患者的预后具有重要价值。

既往研究发现，胞外信号可通过CDK4/CDK6途径影响细胞周期过程，进而通过磷酸化反应形成CyclinE-CDK2复合物，促使细胞反应通过R点，进入细胞分裂期，而肿瘤细胞由于Cyclin D1蛋白过表达，正常的CDK4/6细胞增殖途径失控，导致其无限增殖，因此抑制CDK4/6途径是抗肿瘤的重要机制之一[13-14]。临床研究发现CDK4/6抑制剂单药或联合化疗药物对于晚期乳腺癌起到了延长无进展生存期和总生存期的作用[15-16]。CD133最初作为造血祖细胞的特异性标志物被发现，后又被证明可用于分离鉴定肿瘤干细胞，是1种新兴的细胞表面标志物分子[17-18]，在肿瘤方面，研究发现，CD133在卵巢组织中表达上调与卵巢癌预后不良有关，而靶向CD133的溶瘤腺病毒可选择性感染CD133_结直肠癌细胞，表现出一定的靶向治疗潜力，对于预测结直肠癌转移和复发具有一定的价值[19]。本研究通过免疫组化法研究了骨肉瘤组织及骨软骨瘤组织中CDK4、CD133蛋白的表达情况，结果显示CDK4、CD133蛋白在骨肉瘤组织中表达显著上调，与洪峰、Zhou等[20-21]报道结果一致，证明了CDK4、CD133蛋白可能参与了骨肉瘤的发病过程。本研究进一步探讨了CDK4、CD133蛋白与骨肉瘤患者临床参数的关联，结果显示CDK4、CD133蛋白在外科分期为Ⅲ期及发生肺转移的患者中阳性率明显较高，说明CDK4、CD133可能参与了骨肉瘤的病理进展及肺转移过程，因此，通过检测CDK4、CD133对于判断骨肉瘤分期及肺转移具有一定的价值，但CDK4、CD133蛋白与其它临床参数之间的联系在本研究中未体现，有待进一步的研究。为了探讨CDK4、CD133蛋白在骨肉瘤患者预后中的价值，本研究采用Logrank法比较了CDK4、CD133不同表达患者的OS，结果显示CDK4阳性、CD133阳性骨肉瘤患者OS均显著低于CDK4阴性、CD133阴性的患者，证明CDK4、CD133对于判断患者预后具有一定的价值。

综上所述，本研究结果证明了CDK4及CD133蛋白在骨肉瘤组织中表达增加，与外科分期、肺转移及患者预后有关，但由于样本量较少且未进行体外研究等缺点，CDK4及CD133蛋白用于骨肉瘤患者临床诊断、治疗及预后判断中的价值及其发挥作用的机制有待更进一步的研究完善。