VSTM2A、MICA基因多态性与宫颈癌发病风险的关联性

许冰霜 鲁 希 李东豫

宫颈癌为女性第二大常见肿瘤类型。国内外对宫颈癌遗传背景[1]的研究多集中在基因多态性。单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms，SNP) 为基因组中范围最广的变异类型，体现了个体差异DNA序列最基本变化形式，人体中90%以上的DNA变异和SNP有关[2]。V-组跨膜结构域包含物2A(V-set and transmembrane domain containing 2A，VSTM2A)蛋白由前脂肪细胞分泌，在大脑、前列腺、睾丸、胃、结肠、小肠、肾上腺、神经中呈现高表达，在子宫中表达极低[3]。主要组织相容性复合体Ⅰ类相关基因A(major histocompatibility complex classⅠchain-related geneA,MICA)位于HLA-B基因位点上游，具高度多态性，与多种肿瘤类型如胃癌、皮肤癌等有关[4]。本研究对VSTM2A、MICA基因多态性进行检测，探讨其与宫颈癌发病风险的关联性，为宫颈癌的早期诊断提供基因学证据，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取本院2019年1月至2020年4月收治的105例宫颈癌患者(病例组)以及105例正常健康者(对照组)。病例组患者均经宫颈多点活检病理或手术病理证实为宫颈癌，病灶原发于宫颈，于本院就诊，无合并其他癌症，既往未接受过放疗或者化疗，明确病理类型、临床分期、淋巴结转移等，年龄31～78岁，平均(59.60±10.28)岁；孕次0～6次，平均(2.80±0.61)次；产次0～4次，平均(2.06±0.50)次。对照组女性，有性生活史，无肿瘤病史和临床体征，已行子宫颈癌筛查排外宫颈癌，年龄30～79岁，平均(59.71±10.30)岁；孕次0～6次，平均(2.79±0.57)次；产次0～4次，平均(2.09±0.49)次。病例组与对照组年龄、孕次、产次比较，未见明显差异(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集所有研究对象外周静脉血3 ml，EDTA抗凝，混匀后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 基因组DNA提取 使用贝克曼AMPurea XPDNA血液基因组提取试剂盒进行血液样本基因组提取，严格按照说明书操作，提取后，检测样本纯度，合格后保存于-70 ℃保存待用。

1.2.3 引物设计 针对VSTM2A基因的rs7457728 SNP位点，MICA基因的rs2516448 SNP位点，美国Sequenom公司设计引物，引物合成由上海生物工程技术服务有限公司负责。引物序列：①rs7457728：上游:AGTTCTTCTTCAATTTCTTTCATAGGT；下游：TTCATGCAACACTGTAGAGCT。②rs2516448 ：上游：ACGTTGGATGTCTCCTCCCTTTTTGCATCC ；下游：ACGTTGGATGCTTCATACATACACACACAC。

1.2.4 基因分型分析 通过Sequenom MassAR-RAY 技术对上述SNP位点进行分型。步骤：①目的基因扩增：取基因组DNA适量，依照顺序加至384孔板，PCR扩增，反应物终浓度：基因DNA：5 ng；Taq聚合酶：0.1 U；PCR引物各2.5 pmol、dNTP 2.5 mmol。反应条件：94 ℃，15 min；95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72℃，45 s循环40次，72 ℃，5 min。②SAP反应：剩余dNTP使用0.3 U碱性磷酸酶去除，条件：37 ℃，40 min；85 ℃，5 min。③单碱基延伸：添加5.4 pmol延伸引物以及dNTP和ddNTP的混合物50 μmol，Thermosequenase DNA聚合酶0.5 U，反应条件：94 ℃，2 min；94 ℃，5 s；55 ℃，5 s；72 ℃，5 s循环35次；72 ℃，3 min。④脱盐、上机：将产物树脂脱盐15 min，点样于SpectroCHIP芯片，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱检测芯片。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，组间基因频率比较采用卡方检验，通过多因素logistic回归分析VSTM2A、MICA基因型与宫颈癌发病风险的关系，P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 等位基因频率分布

病例组VSTM2A基因的rs7457728位点中C基因频率高于对照组(P<0.05)；病例组MICA基因的rs2516448位点中T基因频率高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 病例组与对照组等位基因频率分布比较(频数，%)

2.2 基因型分布

病例组VSTM2A基因的rs7457728位点中CC基因型频率39.05%高于对照组9.52%，GG基因型频率14.29%低于对照组44.76%(P<0.05)；病例组MICA基因的rs2516448位点中TT基因频率37.14%高于对照组22.86%，CC基因频率15.24%低于对照组26.67%(P<0.05)。见表2。

表2 病例组与对照组基因型分布比较(例，%)

2.3 VSTM2A、MICA基因多态性与宫颈癌发病风险的Logistic 回归分析

运用广义模型，对上述差异有统计学意义的2个位点进行Logistic 回归分析，并进行赋值rs7457728(GG型=0，GC型=1，CC型=2)、rs2516448(CC型=0，CT型=1，TT型=2)，对年龄进行校正后，计算相对危险度OR(95% CI)，Logistic回归分析结果显示rs7457728位点中CC型是宫颈癌发生的危险基因型，OR值为1.980(95%CI：1.325～2.959)；rs2516448位点中TT型是宫颈癌发生的危险基因型，OR值为1.508(95%CI：1.029～2.210)。见表3。

表3 VSTM2A、MICA基因多态性与宫颈癌发病风险的Logistic 回归分析

2.4 宫颈癌不同临床病理特征VSTM2A、MICA基因多态性比较

不同分化程度、临床分期、淋巴结转移宫颈癌VSTM2A、MICA基因型分布情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)；非鳞癌VSTM2A基因的rs7457728位点中CC基因型频率高于鳞癌(P<0.05)；而不同组织类型MICA基因型分布情况比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 宫颈癌不同临床病理特征VSTM2A、MICA基因多态性比较/例

3 讨论

癌症的发生与发展是多因素综合的结果，除与区域性、社会经济、受教育情况、性伴侣个数、首次性生活年龄、早育、多产、避孕情况、吸烟、饮酒、饮食习惯、家族史等生物行为有关外，还与个体基因及遗传因素息息相关[5]。研究显示[6]，基因遗传度可解释20%以上宫颈癌发生易感性，且疾病的基因遗传效应较肺癌、结直肠癌等均更高，这提示基因多态性可能在宫颈癌发生发展过程中具有重要作用。

CHEN D等[7]在一项对于瑞典人宫颈癌的全基因组关联研究(GWAS)中发现了MHC-rs2516448位点，并认为该位点基因多态性和宫颈癌发生密切相关。rs2516448是和A5.1连锁的一个位点，A5.1是MICA的移码突变点之一。MICA位于HLA Ⅰ类基因编码区，含5个内含子以及6个外显子，由于G核苷酸插入A5.1等位基因位置，造成移码突变，终止密码子TAA的出现提前，MICA基因表达改变，造成蛋白质分子缩短[8]。研究显示[9]，大多数细胞中，此MICA基因不表达，但当病毒感染或是恶性肿瘤发生时，均可发现高频率表达，这主要是由于机体感染或肿瘤细胞出现时，T细胞和NK细胞上表达的NKG2D能激活MICA。目前，MICA-A5.1的基因多态性已被证实和某些肿瘤的发生有关[10]。本研究中病例组T等位基因频率高于对照组，TT基因型是宫颈癌发生的独立危险因素，与上述研究结果一致。

VSTM2A定位于人体染色体7p11.2，7p11中，信号LD区中VSTM2A是唯一蛋白质编码基因[11]。目前临床上关于VSTM2A 在人体中作用研究较少，和恶性肿瘤之间的关系研究就更少。最新有关子宫癌的GWAS研究提示[12]，7p11区，VSTM2A的rs7457728位点与子宫癌易感性显著关联。本研究发现VSTM2A基因的rs7457728位点多态性与子宫癌的发生相关，VSTM2A基因的rs7457728位点携带G/G比携带G/C及C/C基因型的个体易患子宫癌腺癌的风险增加。与此同时本研究分析宫颈癌患者临床病理特征与VSTM2A基因的rs7457728位点的关系，结果显示非鳞癌VSTM2A基因的rs7457728位点中CC基因型频率高于鳞癌。

综上所述，VSTM2A基因的 rs7457728位点和MICA的rs2516448位点基因多态性与宫颈癌的发病风险有关，rs7457728位点中的CC基因型与rs2516448位点中的TT基因型可能是宫颈癌易感基因型。