XAGE-1b在肝癌增殖侵袭中的生物学作用

门 慧 谈 顺

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率及死亡率均呈上升趋势，死亡率位居第三位[1]，由于起病比较隐匿，大多患者难于早期发现，直至进展至中晚期才确诊。由于缺乏有效的监测手段，临床治疗手段如射频消融、肿瘤切除等都会受到不同程度限制，进而错过最佳治疗时机，严重影响患者预后及生存[2-3]。

查阅文献发现，XAGE-1属GAGE 家族，2000年，Liu等研究发现该基因定位于人染色体Xp11.21-Xp11.22上，全长611 bp，包括3个内含子和4个外显子，XAGE-1有4种转录异构体，依次为XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c和XAGE-1d，其中XAGE-1a、XAGE-1c 和 XAGE-1d表达谱较窄，XAGE-1b却具有较广泛表达谱、表达率及免疫原性而被广泛研究。XAGE-1b是主要的转录本存在形式，由于表达模式及序列具有相似性，亦属于CT(癌-睾丸)抗原家族[4-5]。XAGE-1b在除睾丸、胎盘、脑及卵巢组织以外的正常组织中几乎不表达[6]，但在肿瘤组织中广泛表达，XAGE-1b表达见于黑色素瘤[7]、尤文氏肉瘤[4]、肺癌[8-10]、膀胱癌[10]、涎腺腺样囊性癌[11-12]、胃癌[13]、乳腺癌[13-14]、结直肠癌[15-16]、前列腺癌[17-18]、肝癌[19-21]。研究发现XAGE-1b在肝癌的有显著表达，与患者预后呈负相关，敏感度大于AFP监测[19-21]，但XAGE-1b在肝癌的生物学作用至今没有报道。本研究将探讨XAGE-1b在肝癌增殖侵袭的作用，为肝癌患者治疗提供更深入的靶向依据。

1 材料与方法

1.1 材料

肝癌细胞株来自海口市人民医院，干扰载体购于广州锐博生物科技有限公司，1640细胞培养液、胎牛血清购于BI生物公司，0.25%消化细胞胰酶购自Life公司，Matrigel基质胶、Boyden小室购于美国BD公司，CCK-8检测试剂盒购于日本同仁公司，TRIzol、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购于TaKaRa公司，4 ℃超速离心机购于Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 培养人肝癌细胞株需要含10%胎牛血清1640培养液，并放于37 ℃、5%CO2细胞培养箱，培养过程中注意无菌操作以及胰酶消化时间，待细胞状态佳时进行实验。

1.2.2 细胞转染干扰载体 XAGE-1b干扰片段(sense,5′-GCTGCATCAGTCAAACACC-3′)，siRNA成品为粉末，先加入250 μl无菌DEPC水配制成10 μM/l工作液置于-20 ℃保存。选取生长状态良好细胞于前一天铺6孔板，细胞融合度达50%～70%，细胞贴壁后使用lipo2000转染，用opti-MEM培养基给细胞换液1.5 m/孔，配制A液及B液，各250 μl/孔，A液：245 μl optiMEM+5 μl lipo2000，B液：240 μl optiMEM+10 μl SiRNA。A液配好后室温静置孵育5 min，加到配好B液中混匀，孵育205 min，将混合液缓慢滴入6孔板中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养4～6 h，更换含10%血清培基培养，24～48 h后提取RNA。

1.2.3 荧光定量PCR 培养细胞至细胞铺满瓶底，先吸出培养基，再用PBS洗1～2次，加入1 ml Trizol试剂进行冰上裂解(5 min)，吹打细胞，再加入氯仿(0.2 ml氯仿/1 ml trizol)混匀吹打细胞，再冰上裂解2～3 min，将裂解液收集EP管中，4 ℃、12 000 rpm离心机离心15 min，吸取上层水相移并移至去酶的1.5 ml EP管，在剩余沉淀中加入等体积异丙醇，在室温中静置10 min，4 ℃、12 000 rpm离心机离心10 min，去除上清，留沉淀，沉淀物用已处理过的DEPC水配制成的75%乙醇进行洗涤，4 ℃、12 000 rpm离心机离心5 min，重复1遍，室温放置至沉淀自然干燥，加入适量DEPC水溶解RNA，测RNA浓度，进行逆转录反应:把所需逆转录试剂先上下轻颠混匀，小型离心机离心30 s，然后放于冰上备用。按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书进行配制反应体系，在PCR仪中37 ℃反应15 min，85 ℃灭活5 min，进行逆转录，用DEPC水稀释逆转录产物约4倍，-20 ℃保存。第二天进行荧光定量PCR反应，PCR引物序列：(upstream-primer:5'TACTGAGACACGGCGGAC3';down-streamprimers:5'TTCCATGTCGCGCACTG3')，按照TaKaRaRT-PCR试剂盒说明书进行配制反应体系，在QPCR仪中依次95 ℃预变性10 min、95 ℃ 15 sec、60 ℃约30 sec、72 ℃ 34 sec，40个循环数。于7500 Fast Real-Time PCR仪取得各模板Ct值，我们采用Folds=2-ΔΔCt值代表基因表达，按照计算公式△△Ct=Ct(实验组)-Ct(对照组)实验重复3次。

1.2.4 CCK8细胞增殖实验 选用细胞状态良好癌细胞进行实验，弃掉培养基，PBS洗1～2次，0.25%胰酶消化细胞，把细胞收集于无菌EP管，置于900 rp离心机离心4 min，弃掉培养基，空培洗涤细胞2次，用空培重悬细胞并调整细胞密度，计数板计数，按照每孔1×103个细胞接种至96孔板并每孔体积100 μl，同时再设5个复孔/每组以及1个blank对照孔(仅加培养基)，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养7天；在铺板24 h后即测第一天OD值，步骤：弃掉培养基，加入含10%胎牛血清1640液与CCK8试剂混合液(10∶1)，110 μl/每孔(避光操作)，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱孵育2小时后取出96孔板，在酶标仪进行测值，先将blank对照孔调零，再检测每个孔450 nm处吸光度值(OD值)，OD比值象征细胞增殖能力，每组所设5个复孔平均值，依次连测7天，最后绘制增殖曲线。

1.2.5 Boyden小室细胞侵袭实验 选用细胞状态良好癌细胞进行实验，先将小室预处理，滤膜上铺基质胶(RPMI-1640液稀释的Matrigel基质胶按照1∶5混合)，50 μl配置胶/小室，整个操作需在冰上进行，迅速把小室置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱2～3 h(使胶发生凝固)，然后置于超净台紫外照射2 h进行杀菌，再加入适量空培并在细胞培养箱孵育1 h(水化)，在超净台中吸出上室中用于水化培养液，下室内加入600 μl含10%胎牛血清1640液，最后在上室中加入200 μl细胞悬液(细胞数200×103个)，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养48～72 h(目的使细胞进行穿膜运动)，取出小室轻轻擦掉上室内未穿过细胞(棉花或棉棒)，PBS液轻轻洗小室3次(避免用力)，甲醇液固定20～30 min，PBS液轻轻洗3次，苏木精染液染色40 min，镜下观察穿过膜细胞数，选取上、下、左、右、中心5个视野200倍光镜下拍图，细胞计数取均值。

1.3 统计学分析

应用Graphpad Prism 6统计软件进行统计学分析，两组均数间的比较采用配对样本t检验，多组均数间比较采用方差分析法，取α=0.05为检验标准。

2 结果

2.1 QPCR检测肝癌细胞株中XAGE-1b内源性表达

荧光定量Q-PCR检测3株肝癌细胞株7721、97H、HepG2中XAGE-1b的mRNA表达水平，XAGE-1b的表达水平由高至低依次为7721、HepG2、97H(图1)。

图1 QPCR检测3株肝癌细胞株中XAGE-1b的mRNA内源性表达情况

2.2 QPCR检测干扰载体的干扰效率

QPCR检测XAGE-1b干扰载体感染7721细胞后XAGE-1b的mRNA表达水平，与NC组相比，SI组mRNA水平显著降低(P<0.01，图2)。

图2 QPCR检测XAGE-1b的干扰效率

2.3 CCK8检测XAGE-1b干扰后对肝癌细胞增殖能力的影响

与NC组相比，7721SI组细胞株增殖率明显降低(P<0.01，图3)。结果表明，XAGE-1b干扰组增殖能力明显降低，干扰XAGE-1b抑制肿瘤细胞的体外增殖能力。

图3 CCK8检测XAGE-1b干扰后7721细胞株的体外增殖情况

2.4 Boyden小室细胞侵袭实验检测XAGE-1b干扰后对肝癌细胞侵袭能力的影响

与NC组相比，7721SI组细胞穿过小室膜数目显著减少(P<0.01，图4)。结果表明，干扰XAGE-1b抑制肿瘤细胞的体外侵袭能力。

图4 Boyden小室细胞侵袭实验检测XAGE-1b干扰后7721细胞株体外侵袭情况

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤，复发及转移是常见的死亡原因，由于起病比较隐匿，难于早期发现，因此采取有效的监测手段是早发现早治疗的关键。XAGE-1b因具有较广泛表达谱、表达率及免疫原性而被广泛研究，XAGE-1b的血浆mRNA及蛋白可作为肿瘤标记协助临床诊断[20]。

XAGE-1属于GAGE 家族，有4种转录异构体，依次为XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c 和 XAGE-1d，XAGE-1b是主要的转录本存在形式。XAGE-1b在除睾丸、胎盘、脑及卵巢组织以外的正常组织中几乎不表达，但在肿瘤组织中广泛表达，见于黑色素瘤、尤文氏肉瘤、胃癌、涎腺腺样囊性癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等多肿瘤中，在生物学功能方面，XAGE-1b可以促进涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭、转移及血管生成[22]。XAGE-1b在肝癌中亦有表达且与患者预后相关，但其在肝癌中的生物学行为至今没有研究。

本研究我们通过QPCR检测3株肝癌细胞株XAGE-1b的mRNA内源性表达情况，选取表达量最高1株肝癌细胞株7721进行研究，采用XAGE-1b干扰载体转染7721细胞株，QPCR检测XAGE-1b的mRNA干扰效率，然后采用CCK8细胞增殖实验、Boyden小室细胞侵袭实验进行体外生物学作用分析，发现干扰XAGE-1b能够抑制肝癌细胞体外增殖、侵袭能力，说明XAGE-1b表达与肝癌的增殖、侵袭能力密切相关。

本研究结果表明，沉默XAGE-1b后肝癌细胞的体外增殖、侵袭能力明显降低，但XAGE-1b的相关作用机制仍不清楚，有待进一步深入研究。XAGE-1b有望成为肿瘤标记物的筛查指标，为临床肿瘤诊治及新药研究提供新的靶点依据，进一步提高患者生存质量。