二陈汤对多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织IRS-1／IRS-2的调节作用

陈锦明，王维斌，张 萍，黄 娜，邓 姣，俞 洁*

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州350122；2.丽水市第二人民医院，浙江 丽水323000）

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性常见的内分泌紊乱性疾病之一，与女性不孕不育有密切联系。据报道，临床约有50%～70%的PCOS患者存在胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）现象［1］。研究发现，在卵巢组织中存在能够介导胰岛素作用的所有信号蛋白和代谢酶，且PCOS患者卵巢组织中出现IR现象，当前研究认为其分子机制主要与胰岛素信号传导通路环节异常相关［2］。在西医药物治疗方面，主要应用二甲双胍等胰岛素增敏药物。研究发现，应用化痰法能够有效改善PCOS合并IR患者的临床症状，提高临床治疗的总有效率，且安全性较应用二甲双胍高［3］。而针对化痰法改善PCOS卵巢组织IR现象的作用途径却少有报道。因此，为进一步探讨化痰法改善卵巢组织IR的生物学机制，本实验研究了化痰法对PCOS模型大鼠卵巢组织胰岛素受体（insulin receptor，INSR）底物IRS-1和IRS-2 mRNA及蛋白表达水平的影响，为PCOS的临床治疗提供部分参考依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 21日龄SPF级SD雌性大鼠40只，体质量（50±10）g，均购于上海斯莱克动物有限责任公司，许可证号：SYXK（闽）2014-0001，动物合格证编号：2015000540932。饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级屏障系统，许可证编号：SYXK（闽）2014-0001，饲养环境温度及湿度恒定，温度（20±2）℃，湿度40%～60%，12 h周期性光照环境。本实验已通过福建中医药大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 实验药物 二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司，批号：H20023370）。二陈汤药物组成：陈皮15g，姜半夏15g，茯苓9g，炙甘草4.5g，委托福建省第三人民医院制备，4℃条件下保存备用。

1.3 实验试剂 脱氢表雄酮（DHEA，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10098326）；逆转录和SYBR试剂盒（日本TAKARA公司，批号AI21033A、AI12394A）；注射用大豆油剂（江西益普生药业有限公司，批号：20160602）；羊抗兔二抗（英国MDL公司，批号：MD2141）；兔抗胰岛素受体底物（IRS）-1一抗，兔抗IRS-2一抗，兔抗β-actin一抗（英国Abcam公司，批号分别为ab53167、ab134101、ab8227）；苏木素-伊红染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180727）。

1.4 实验仪器 QuantStudio6 Flex型实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；ChemiDoxTMXRS＋型化学发光凝胶成像仪、170-3940型半干转印槽、170-3930型垂直电泳系统、170-4070型转膜仪（美国Bio-Rad公司）；SHP-250型生化箱（上海精宏实验设备有限公司）；Infinite M200 Pro多功能酶标仪（奥地利Tecan公司）；Nandrop2000型超微量紫外分光光度计（美国Thermo Scientific公司）。

2 实验方法

2.1 动物造模与分组 采用DHEA诱导PCOS模型大鼠［4］。将40只21日龄SPF级SD雌性大鼠，适应性喂养2 d后，按体质量由大到小的顺序依次编号，采用随机数字表法分为正常组12只和造模组28只。造模组大鼠每日于颈背部皮下注射DHEA［6mg／（100 g·d）＋0.2mL注射用大豆油］，正常组每日颈背部皮下注射0.2mL的注射用大豆油，连续注射20 d。造模结束后，将成模大鼠按体质量从大到小依次编号，采用随机数字表法分为模型组、二陈汤组、二甲双胍组各8只。二陈汤组按4.35 g／（kg·d）予二陈汤灌胃，二甲双胍组按0.158mg／（kg·d）予二甲双胍灌胃，模型组及正常组给予等体积灭菌饮用水灌胃，分别干预4周后取材。实验期间均采用普通饲料喂养。

2.2 ELISA法检测大鼠血清指标 根据ELISA试剂盒说明书进行操作，在450 nm波长下测定各样本OD值，绘制标准曲线后计算出血清雄激素（T）和胰岛素（INS）水平浓度。

2.3 Real-time PCR检测大鼠卵巢组织IRS-1和IRS-2 mRNA表达 将卵巢组织匀浆后，用TRI zol法提取总RNA，逆转录为cDNA后进行PCR反应。引物序列由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，IRS-1（143 bp）：上游5"-CYGCACTCACCCTAG ACCCA-3"，下游5"-TGACTCCGAAATTCACGCCG-3"；β-actin（136 bp）：上游5"-CTCTGTGTGGATTGGTG GCT-3"，下游5"-AGCTCAGTAACAGTCCGCC T-3"；IRS-2（197 bp）：上 游5"-GCATGTTTCCAACCAAC GCT-3"，下游5"-GAGTGTACTCCATCAGCCCT-3"。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火31 s，40个循环。以β-actin为内参，采用相对定量分析法进行分析。

2.4 Western blot检测大鼠卵巢组织IRS-1和IRS-2蛋白表达 从大鼠卵巢组织中提取总蛋白，运用BCA蛋白定量法测定所提取的蛋白浓度，根据不同蛋白分子量分离相应胶带，并将蛋白转移至PVDF膜上。抗体稀释比例：IRS-1、IRS-2一抗（1∶1500），β-actin一抗（1∶5000）；IRS-1、IRS-2、β-actin二抗（1∶2000）。ECL发光检测，以β-actin为内参，应用Image Lab软件进行灰度分析。

2.5 统计学方法 采用SPSS 23.0进行数据统计学分析。符合正态分布的计量资料，采用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析；若方差齐性，采用LSD方法分析；若方差不齐，选择Dunnett T3方法进行两两比较。

3 结果

3.1 4组大鼠血清T、INS浓度比较 见表1。

表1 4组大鼠血清T、INS浓度比较（±s）

表1 4组大鼠血清T、INS浓度比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

INS／（mU／L）0.41±0.050.49±0.050.42±0.140.38±0.06组别正常组模型组二甲双胍组二陈汤组n 8888 T／（nmol／L）0.37±0.112.96±1.231）0.43±0.162）0.42±0.152）

3.2 4组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2 mRNA水平比较 见表2。

表2 4组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2 mRNA水平比较（±s）

表2 4组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2 mRNA水平比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

IRS-21.06±0.460.20±0.051）0.75±0.072）0.81±0.192）组别正常组模型组二甲双胍组二陈汤组n 8888 IRS-11.07±0.340.63±0.151）1.02±0.242）0.91±0.283）

3.3 4组大鼠卵巢组织IRS-1和IRS-2蛋白表达比较 见表3、图1。

图1 4组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白电泳图

表3 4组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白表达比较（±s）

表3 4组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。

IRS-20.51±0.050.27±0.021）0.41±0.022）0.50±0.022）组别正常组模型组二甲双胍组二陈汤组n 8888 IRS-10.58±0.060.28±0.061）0.41±0.070.57±0.072）

4 讨论

IR是PCOS重要的病理生理基础，IRS-1和IRS-2作为胰岛素受体后信号传导的主要船坞蛋白，与胰岛素信号转导关系最为密切［5］。研究发现，PCOS患者的卵泡膜细胞中IRS-1及IRS-2表达水平明显升高［6］，而PCOS-IR仅表现出胰岛素代谢功能异常，其甾体激素分泌功能未受影响，IRS-1及IRS-2的表达水平升高会促使卵泡膜细胞分泌过量的雄激素，导致卵巢局部高雄激素血症的发生［7-8］。因此，临床中常应用胰岛素增敏剂，促使PCOS患者的胰岛素敏感性增强，改善胰岛素抵抗，同时有效降低雄激素水平［9］，从而降低卵泡发育异常及排卵障碍。本研究结果显示，模型组大鼠血清T水平明显升高，血清INS水平也出现升高趋势，卵巢组织中IRS-1、IRS-2的mRNA和蛋白表达水平均显著下降，说明模型组大鼠出现高雄激素血症且卵巢组织中出现胰岛素信号通路环节异常，这将提高卵巢组织局部的高雄激素血症及胰岛素抵抗发生的可能，从而导致卵泡的发育与排卵受到影响。

在PCOS中医证型分布中，痰湿证的占据比例高［10］。张红阳等［11］通过研究不同稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的PCOS患者中医体质分布规律，发现不同HOMA-IR组中痰湿质所占比均较高，提示“痰湿”与IR之间存在一定关系。郝松莉等［12］进一步对比分析痰湿型与非痰湿型PCOS患者的临床生化特征，发现痰湿型PCOS患者较非痰湿型存在更为明显的糖脂代谢以及胰岛素异常。本研究以化痰法经典代表方剂二陈汤作为干预手段，探讨化痰法对PCOS大鼠卵巢组织胰岛素受体底物表达的影响。结果显示，与模型组比较，二陈汤组IRS-1、IRS-2 mRNA及蛋白水平均明显升高，提示二陈汤可能通过改善卵巢组织中蛋白受损状态，调节卵泡的胰岛素受体信号传导通路，提高对胰岛素的敏感性，使胰岛素与受体结合的能力恢复；同时血清T水平明显降低，提示二陈汤可改善卵巢局部激素环境，其作用机制是否同胰岛素增敏剂调控卵巢组织糖代谢的同时影响卵巢的内分泌功能，还有待进一步的研究证实。

综上所述，二陈汤化痰法可以降低PCOS模型大鼠血清T水平，使卵巢局部微环境得到改善，促进卵巢组织中胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2 mRNA及蛋白水平的表达上调，从而提高卵巢组织对胰岛素的敏感性，加强对胰岛素的利用，进而改善卵泡IR状态。