八角茴香挥发油防治新型冠状病毒肺炎的潜在作用机制▲

黄丹娜 陈 路

(1 黑龙江中医药大学，哈尔滨市 150040，电子邮箱:dhuang202@126.com；2 广西壮族自治区药用植物园，西南濒危药材资源开发国家工程实验室，南宁市 530023)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)疫情的迅速蔓延给人类社会带来巨大的威胁，其已成为当今全球关注的主要问题。目前尚无针对COVID-19的特效药物，因此对现有药物的重新利用研究可能会为遏制这一流行病带来希望[1]。COVID-19的临床表现主要为发热、干咳和乏力[2]，在中医学中其属于“寒疫”[3]“寒湿疫”[4]“湿毒疫”[5]病范畴。张伯礼院士提出，应在化湿解毒、辟秽化浊的基础上对COVID-19患者因证施治[4]。芳香化湿之品具有祛浊避秽功效，因此古法防治瘟疫多用香囊[4]。八角茴香是一种药食同源的常用香料，为木兰科植物八角茴香的干燥成熟果实，性味辛温，归肝、肾、脾、胃经，有温阳散寒、理气止痛之功效[6]。八角茴香具有抗菌、抗病毒和抗氧化的特性，不仅长期在我国的中医药领域中得到应用，在印度传统医药阿育吠陀体系也被用于治疗肠胃气胀、痢疾、咳嗽、哮喘、风湿性关节炎等疾病[7]。八角茴香主要含挥发油，是其发挥药效的重要成分，也是其最有商业价值的部分[8]。网络药理学是近年来新兴的一门学科，是基于系统生物学、多向药理学的研究方法，其将生物学网络与药物作用网络整合，在药物与疾病和靶点之间构建“多成分、多靶点、多途径”协同作用关系，从而揭示药物治疗疾病的作用机制[9-10]。本文利用网络药理学联合分子对接方法，研究八角茴香挥发油有效成分及其靶点、疾病及生物通路的相互作用关系，预测其干预COVID-19的可能分子机制，为后续药物研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 八角茴香挥发油主要活性成分与靶点的筛选 本课题组前期已采用气相色谱-质谱联用法对八角茴香挥发油的成分及含量进行了分析[11]，从该实验结果中选取了4个相对含量≥1%且具有生物活性的化合物作为研究对象，分别是松油烯、萜品油烯、桉叶油醇、反式茴香脑(见表1)。通过TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)数据库，检索主要活性成分的靶蛋白，并剔除没有靶点的化学成分。同时，通过UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)，限定物种为“human”，查询靶蛋白对应的基因，进行基因名称标准化并去重。

表1 八角茴香挥发油4个活性成分的信息

1.2 八角茴香挥发油干预COVID-19的作用靶点预测 以Corona Virus Disease 2019和COVID-19为检索词，分别在GeneCards(www.genecards.org)、OMIM(https://omim.org/)和CTD(http://ctdbase.org/)数据库进行检索，检索时间为建库至2020年7月31日。将3个数据库检索结果合并，去除重复，获取COVID-19相关靶点，利用微生信线上软件(http://www.bioinformatics.com.cn/)将获取的靶点与八角茴香挥发油化学成分靶点映射，得到共同靶点作为八角茴香挥发油干预COVID-19的潜在作用靶点。将八角茴香挥发油的活性成分与其干预COVID-19的潜在作用靶点导入Cytoscape 3.6.0软件，构建其成分-靶点-疾病网络。

1.3 蛋白相互作用网络的构建与分析 将八角茴香挥发油干预COVID-19的潜在作用靶点导入STRING在线分析系统(https://string-db.org)，种属选择“Homo sapiens”，最低置信度分值设置为0.4，获得蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)关系，以TSV文件格式保存。再将数据导入Cytoscape软件进行可视化处理和拓扑分析，筛选关键靶点。

1.4 靶点的富集分析 将八角茴香挥发油干预COVID-19的潜在作用靶点导入Metascape在线分析系统(http://metascape.org)进行基因富集分析，阈值设定为P≤0.05，得到基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析结果和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析结果。

1.5 主要活性成分与靶点分子对接验证 采用SwissDock在线软件(http://www.swissdock.ch/)进行分子对接，使用UCSF Chimera软件对分子结构进行处理，评价活性成分与新型冠状病毒3CL水解酶(Mpro)、新型冠状病毒受体血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)之间的对接效果，选取抗病毒药利巴韦林作为对比；选取PPI网络中Degree值排名前2的两个关键靶点(PTGS2、JUN)，分析活性成分与关键作用靶点之间的对接效果。

2 结 果

2.1 八角茴香挥发油的活性成分及靶点 利用TCMSP和TCMID在线数据库，获得松油烯、萜品油烯、桉叶油醇、反式茴香脑这4种活性成分所对应的靶蛋白共76个，输入UniProt数据库进行基因名称标准化并删除重复值，得到52个靶点。

2.2 八角茴香挥发油干预COVID-19的作用靶点 从GeneCards、OMIM和CTD数据库中筛选出与COVID-19相关的基因共5281个，与八角茴香挥发油活性成分的52个靶点相映射，得到 26个八角茴香挥发油干预COVID-19的潜在作用靶点(图1-A)。将疾病、活性成分、潜在作用靶点导入 Cytoscape软件构建活性成分—靶点—疾病网络(图1-B)。

图1 八角茴香挥发油与COVID-19之间的网络构建

2.3 PPI网络分析 利用STRING 数据库，针对八角茴香挥发油干预COVID-19的26个潜在作用靶点构建PPI网络(图2-A)，寻找靶点之间的直接及间接作用关系。利用Cytoscape软件分析和处理数据(图2-B)，网络中节点的颜色深浅和大小与Degree值成正比，Degree值越大表示参与的生物功能越多；前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、JUN、核受体亚家族3C组成员1(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1)、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、RELA、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、MMP2、肾素等靶点的Degree值≥10，明显高于平均值7.77，因此可能是关键作用靶点。

图2 潜在作用靶点PPI网络图

2.4 靶点富集分析 由GO功能富集分析结果(图3)可知，生物过程与有机羟基化合物转运、对有毒物质的反应、胚胎着床、行为、神经递质代谢过程等相关；细胞组分与细胞膜筏、膜微区、膜区、微小洞穴、质膜筏等相关；分子功能与核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体、RNA聚合酶Ⅱ 近端启动子序列特异性DNA结合、近端启动子序列特异性DNA结合等相关。KEGG通路富集分析结果(图4)显示，差异基因主要富集在癌症通路、白细胞介素17信号通路、Th17细胞分化、肿瘤坏死因子信号通路、可卡因成瘾、流体剪切应力与动脉粥样硬化、小细胞肺癌通路、Th1和Th2细胞分化通路、恰加斯病(美洲锥虫病)、T细胞受体信号通路等。

图3 GO功能富集分析结果

图4 KEGG通路富集分析(显示前20条结果)

2.5 分子对接结果 结果显示，八角茴香挥发油有效成分与目标受体之间最低结合能均小于-5.0 kCal/mol，表明均有较好的对接活性[12-13]，见表2。在4个活性成分中，桉叶油醇与PTGS2、JUN、ACE2的对接效果最好，松油烯与Mpro的对接效果最好，见图5。

表2 八角茴香挥发油主要活性成分与相关蛋白的对接效能(kCal/mol)

图5 分子对接结构图

3 讨 论

八角茴香是芳香类药用植物，性味辛温，而辛入肺，辛能通气、开腠理。现代药理研究显示植物挥发油在抗炎、抗菌、抗病毒等方面有优势[14]，因此芳香类中药可以用于改善COVID-19导致的呼吸道及消化道的有关症状。有研究表明，植物挥发油可与病毒包膜直接相互作用并减轻宿主的炎症反应，例如桉叶油醇[15]；萜品油烯和松油烯为单萜物质，均具有较强的抗氧化性[16-17]；而作为八角茴香挥发油的主要成分，反式茴香脑也已被证实具有抑制病毒的活性[18]。因此，本研究选取了八角茴香挥发油中4个活性化合物——松油烯、萜品油烯、桉叶油醇、反式茴香脑进行分析。

本研究结果显示，八角茴香挥发油干预COVID-19的主要作用靶点为PTGS2、JUN、NR3C1、NOS3、RELA、MMP9、MMP2、肾素等。其中，PTGS2又名环氧化酶2，是引起炎性反应的关键酶之一[19]，可通过直接调控p53功能活性抑制DNA损伤诱导的细胞凋亡[20]。近期一项对COVID-19患者肺形态蛋白质组学和致病性特征研究显示，在COVID-19患者肺的代表性切片中可观察到环氧化酶2在肺泡细胞中表达[21]。JUN又称为转录因子复合物 AP-1，是由Jun和Fos等蛋白亚家族形成的二聚体转录因子，主要参与细胞增殖、转化和死亡[22]。AP-1在前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌等肿瘤中表达失调,参与肿瘤形成和发展。另外，AP-1的过度活化也已被确定为哮喘发病过程中糖皮质激素抵抗的机制[23]。而在炎症反应中，糖皮质激素可以抑制促炎性细胞因子的产生并刺激抗炎细胞因子的产生，其作用由NR3C1基因编码的糖皮质激素受体介导[24]。糖皮质激素受体还能与核因子κB、AP-1作用，从而抑制这些转录因子在炎症反应过程中对促炎靶基因的转录[25]。RELA为核因子κB p65亚单位，可对核因子-κB通路进行精准调控，在核因子κB介导的炎症、癌症等多种疾病发生发展过程中起重要作用[26]。MMP家族是锌依赖性的内肽酶，在炎症、肿瘤侵袭和转移以及通过降解细胞外基质和基底膜生成血管过程中发挥重要作用[27]。NOS3基因多态性与一些由血管病变引起的疾病密切相关，如急性心肌梗死、原发性高血压、冠心病和股骨头缺血性坏死等[28]。肾素是研究原发性高血压病因学的一个靶标基因，肾素将血管紧张素原裂解为血管紧张素1，进而被催化为血管紧张素2，从而影响血压和电解质平衡[29]。以上提示，八角茴香挥发油的活性成分可能通过抗炎、抗癌、影响心血管系统等对COVID-19起到干预作用。

GO功能富集分析结果显示，八角茴香挥发油可能在细胞膜筏、膜微区等位置，通过有机羟基化合物转运、对有毒物质反应等生物学过程与核受体及转录因子等结合而发挥作用。KEGG富集结果显示，八角茴香挥发油可能主要是通过癌症通路作用于PTGS2、JUN、核因子κB相关蛋白、MMP家族(MMP9、MMP2)等靶点达到干预COVID-19 的目的。在前20个主要富集的KEGG通路中，涉及了与癌症相关的信号通路如癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路、小细胞肺癌、前列腺癌等，以及白细胞介素17信号通路、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化、核因子κB信号通路、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路等与免疫和炎症相关的多条通路，还涉及其他如乙型肝炎、恰加斯病(美洲锥虫病)、利什曼病等传染病的信号通路。临床研究显示，COVID-19重症患者出现急性呼吸窘迫综合征的原因可能与细胞因子风暴有关，细胞因子风暴表现为过激的炎症反应，COVID-19患者体内可能存在Th1与Th2反应失衡[30]。因此，除控制病毒复制外，阻止COVID-19患者出现细胞因子风暴也是治疗的关键。另外，临床上发现部分新型冠状病毒感染患者出现了心肌损伤临床征象，发病机制可能与病毒感染直接引起心肌细胞损伤、细胞因子风暴以及ACE2等有关[31]。ACE2是新型冠状病毒结合的靶标蛋白，我国研究人员发现许多肿瘤中出现ACE2突变、拷贝数异常扩增等多种遗传学异常；同时，ACE2在肺腺癌、胰腺癌、胃腺癌等恶性肿瘤中表达显著上调并伴有ACE2启动子区DNA低甲基化[32]。由此可见，基因富集分析与PPI网络拓扑分析的结果相符。本研究认为八角茴香挥发油干预COVID-19的可能机制主要是通过抗肿瘤、抗炎、抗病毒、调节免疫、保护心血管等途径发挥作用。

本研究通过分子对接分析八角茴香挥发油有效成分分别与关键作用靶点PTGS2和JUN的结合能，以及与SARS-CoV-2靶蛋白3CL水解酶和ACE2的结合活性，各分子对接结果的最低结合能均小于-5.0 kCal/mol，说明分子对接稳定，并有可能影响新型冠状病毒感染和复制的潜力。八角茴香挥发油可通过协同作用以发挥更大的防治效果，或者作为辅助药用于增强其他抗病毒药的作用，或者用于缓解COVID-19的症状。

综上所述，八角茴香挥发油活性主要通过抗肿瘤、抗炎、抗病毒、调节免疫、保护心血管等通路，作用于PTGS2、JUN等关键作用靶点达到防治COVID-19的作用，这或可为八角茴香挥发油的后续深入研究以及防治COVID-19天然产物的筛选提供思路和方法，但结果的准确性仍需要临床及基础实验研究进一步验证。