壳聚糖、维生素C及庆大霉素对猪精液保存效果的比较分析

2021-06-09任毅杰赵梦洁吕东良刘卫东胡建宏

畜牧兽医杂志 2021年3期

石武，任毅杰，赵梦洁，吕东良，刘卫东，胡建宏,*

(1 .西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100；2. 陕西省安康市农业综合执法支队)

壳聚糖是生命体中重要的碱性多糖，又被称为几丁聚糖、甲壳胺、甲壳素等，其结构类似于纤维素等大分子，且自身的游离氨基酸具有还原性，因此壳聚糖具有调节免疫力、改善胃肠道和降血脂等功能，并逐渐用于医药、食品和农业等领域的研究。苗志国等研究发现，向育肥猪饲粮中添加0.02%的膨化壳聚糖微粒能够显著改善育肥猪的屠宰性能、提高育肥猪背最长肌营养成分和肌肉中氨基酸含量，并通过影响肌肉中风味氨基酸和不饱和脂肪酸的组成与含量来改善猪肉品质和猪肉的风味。谢东淇研究发现，将0.1 g/L壳聚糖添加于猪精液常温保存稀释液并保存6 d后的精子活率为61.56%，显著提高了精子的质膜、顶体完整率和T-AOC活性，同时精液中的MDA含量和细菌含量显著降低。许国林通过向公猪精液稀释液中添加庆大霉素发现，试验组的精子存活时间和顶体完整率显著高于对照组，且输精后试验组母猪的受胎率为91.05%，显著高于对照组母猪的受胎率82.11%，证明庆大霉素在猪精液保存稀释液中作为添加剂具有一定的应用价值。黄俻华的研究发现，在猪精液稀释液中添加300 μg/mL的维生素C能够显著提高冻后精子的体外存活时间以及CAT酶活；添加600 μg/mL的维生素C可以显著提高解冻精子的活力、线粒体活性、质膜和顶体完整性、存活时间以及抗氧化物酶的活性，同时明显降低精子畸形。本研究旨在通过向猪精液常温保存稀释液中添加适当浓度的壳聚糖、庆大霉素和维生素C来探究其对精液品质的影响，并对其保存效果进行比较分析，以期发现能够替代抗生素且具有良好抗氧化性能的新型添加剂。

我国是养猪大国，猪肉在我国居民饮食消费中占据重要的地位。随着畜牧业的不断发展，猪人工授精技术已广泛应用于生猪养殖，并使生猪养殖企业的生产效益得以提升。精液保存是猪人工授精技术的核心环节，目前在生产实践中已经取得了重大进展。然而，随着精液保存时间的延长，精子会由于自身代谢而产生ROS，大量的ROS堆积会引起精子质膜脂质过氧化，使其通透性发生改变，严重时发生破损，进而导致精子结构完整性被破坏和运动性能降低。同时，猪精液中营养物质丰富、pH适宜等特点使其成为微生物繁殖的良好环境，而细菌污染导致精液保存时间缩短和品质下降。因此，氧化应激和细菌污染是公猪精液常温保存所面临的两大重要障碍，故而如何保障与进一步提升在常温条件下保存的精液品质仍是大型猪场亟需解决的重要问题。基于此现状，本研究将0.1 g/L壳聚糖添加到猪精液常温保存配方中，并与0.25 g/L庆大霉素、0.068 g/L维生素C添加到精液中的保存效果进行对比，通过检测猪精液常温保存第1～6 d的猪精子活力、质膜完整率、顶体完整率和凋亡水平来确定最适浓度的壳聚糖是否可以取代传统抗生素对精液保存的效果，以期为新型、长效猪精液常温保存配方的研发提供一定的试验支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物与精液采集

本试验所采用的试验动物均为西北农林科技大学畜牧站种猪养殖场饲养的10头成年的健康的且营养状况良好的大白公猪。每次的采精时间固定在上午9：30至10：30之间，间隔时间为两天采集1次，一周之内采精不超过3次。采精过程均由试验站工作人员采集，方法为手握刺激法，采精结束后用专用滤纸进行过滤，滤去精皮及其他杂质，确保精液干净无污染。采精过程结束后将精液简易处理迅速前往实验室进行下一步的试验。

1.2 精液处理与保存

对采集的精液进行评估，包括颜色、气味等，一般刚采集的原精为带有腥臭味的乳白色液体。使用血细胞计数版对精子密度进行评估并计算精子密度。利用精子自动分析仪对精子的活力进行检测，检测合格后方可进行下一步试验研究。将配制好的Modena缓冲液和壳聚糖溶液放在37 ℃的恒温水浴加热5 min，取4支灭菌后的5 mL试管并依次编号，分别加入不同种类的抗氧化剂溶液共2.5 mL，使抗氧化剂的浓度分别是0、壳聚糖(0.1 g/L)、庆大霉素(0.25 g/L)、维生素C(0.068 g/L)。再将精液分装到4个干净的5 mL试管中，每管添加新鲜精液2.5 mL，将之前配置的不同种类的抗氧化剂溶液沿着试管壁缓缓倒入精液中，对精液进行1∶1同等体积的稀释。将做好标记的试管用透气干净的毛巾包裹4～5层，放于17 ℃恒温保存箱中保存，每隔10～12 h缓慢翻滚一次精液，使沉淀精子混合均匀。

1.3 猪精液精子活力的检测

取出150 μL精液于200 μL的小试管中，将精液置于37 ℃水浴锅中加热5 min，向提前预热好的洁净的载玻片上滴加10～20 μL的精液，缓慢盖上盖玻片，置于37 ℃的恒温加热板上，调节显微镜的焦距，对准精子视野用CASA系统进行精子活力的检测，每支精液样品随机选择5个视野，每个视野中的精子数在200个以上，结果取其平均值。

1.4 猪精液质膜完整率的检测

采用SYBR-14/PI荧光染色法对猪精液常温保存第1～6 d的精子质膜完整率进行检测。

1.5 猪精液顶体完整率的检测

采用FITC-PNA荧光染色法对猪精液常温保存第1～6 d的精子顶体完整率进行检测。

1.6 猪精子凋亡水平的检测

利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒对猪精液常温保存第1～6 d精子凋亡水平进行检测。

1.7 数据处理

使用Microsoft Excel 2010进行数据统计，利用SPSS 23.0软件进行统计学单因素方差分析(One-way ANOVA)，并利用Duncan’s法进行多重比较，最终数据以Mean ± SD表示。P< 0.05表示差异显著，P> 0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖、庆大霉素及维生素C对猪精子活力的影响

通过CASA系统分析精子活率，如表1所示，三组精子活力在保存6 d后均高于对照组。但在壳聚糖和庆大霉素组中，精子运动性能强于维生素C组和对照组，稀释液中添加0.1 g/L的壳聚糖组精子活动力仅次于庆大霉素组。在保存6 d后，0.25 g/L庆大霉素组的精子活力(62.17%)和0.1 g/L的壳聚糖组(61.67%)显著高于其他组(P<0.05)，表明加入0.1 g/L的壳聚糖可以保护精子质量，减缓精子活力下降。

表1 不同种类的添加剂对猪精子活力的影响 %

2.2 壳聚糖、庆大霉素及维生素C对猪精子质膜完整率的影响

壳聚糖对猪精子质膜完整率的影响如表2所示，稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖、0.25 g/L庆大霉素的精子质膜完整率显著提高。常温保存6 d后，稀释液中添加0.1 g/L壳聚糖组精子质膜完整率为68.67%，仅次于庆大霉素组，显著高于对照组(P< 0.05)。表明添加0.1 g/L的壳聚糖可以在一定程度上替代庆大霉素，提高猪精子质膜完整率。

表2 不同种类的添加剂对猪精子质膜完整率的影响 %

2.3 壳聚糖、庆大霉素及维生素C对猪精子顶体完整率的影响

壳聚糖对精子顶体完整率的影响如表3所示。保存5 d后，与其他组相比，稀释液中添加0.25 g/L的庆大霉素组与添加0.1 g/L壳聚糖组的精子顶体完整率显著改善。保存6 d后，添加0.25 g/L的庆大霉素组精子顶体完整率为75.17%，显著高于其他组(P< 0.05)。表明添加0.1 g/L的壳聚糖可以在一定程度上替代庆大霉素，提高猪精子顶体完整率。

表3 不同种类的添加剂对猪精子顶体完整率的影响 %

3 讨论

精子活力、质膜、顶体完整性对精子至关重要，影响人工授精的受精率。庆大霉素是较常用的抗生素之一。Schulze等研究表明，庆大霉素对精液内细菌有较强的抑制作用，其处理后的精子活力、顶体、质膜完整性均高于对照组。维生素C是常用的抗氧化剂，瞿静雯等等研究表明在山羊精液冷冻稀释液中添加维生素C，可以提高精子活率、顶体完整率和存活时间。同样在猪上也得到了相似的结论，任子利等研究发现，将5.0 g·L-1维生素C添加到改良的猪精液稀释液中能够显著提高精子活力、顶体完整率和质膜完整率，并且明显降低4 ℃保存时的精子畸形率和对藏猪精液精子全基因组DNA甲基化的影响。本试验结果表明，在猪精液常温保存稀释液中添加壳聚糖可以有效提高猪精子活力、质膜完整率和顶体完整率，且效果介于庆大霉素和维生素C之间。

优良的猪精液保存效果是在生产实践中推广人工授精技术的关键，然而猪精液中营养物质丰富、pH适宜等特点使其成为微生物繁殖的良好环境。因此，在猪精液保存稀释液中加入适宜浓度的抗菌物质能够抑制精液中微生物的生长和繁殖，进而延长精液的保存时间，并改善精液的保存效果。本研究表明壳聚糖添加组和庆大霉素添加组最能提高精子活力，且两者在保存2 d内差异不显著，说明壳聚糖可能通过抗菌途径来提高精液保存质量。壳聚糖组合庆大霉素组的质膜完整率和顶体完整率均高于对照组和维生素C添加组，而且在保存过程中维生素C添加组和对照组之间也是差异显著的。与本研究结果相似，Chang-Bum等发现壳聚糖能够在一定程度上保护被H2O2损伤的肝细胞，这是因为壳聚糖作为天然碱性多糖能够在生物体内外通过激活Nrf2通路来诱导相关抗氧化酶基因表达，进而在一定程度上抵抗细胞的氧化损伤。高晶晶等的研究发现，从虾蟹壳中提取的壳聚糖具有较强的抗氧化能力，能够清除生物体细胞内的二苯基苦基苯肼自由基和羟自由基，这与本试验结果不同。本试验结果表明，维生素C清除羟自由基和二苯基苦基苯肼自由基的能力强于壳聚糖，这可能由于壳聚糖分子量不同导致。Kyung等分别采用DPPH自由基清除能力法及硫代巴比妥酸法评价了壳聚糖分子质量分别为3×104、9×104、12×104U的抗氧化性能，发现3×104U的壳聚糖抑制脂质过氧化的效果更强。同样，Hisao等分别研究了7种不同分子质量的壳聚糖在细胞内和体外两种环境下的抗氧化性，发现高分子质量壳聚糖处理组的抗氧化性能效果不佳，而低分子质量壳聚糖处理后的血浆蛋白发生过氧化的程度明显降低，在对ABTS自由基和DPPH自由基的测试中，也表现出了同样的规律。在本研究中，壳聚糖能够提高猪精子活力的原因可能是因为其作为一种抗氧化剂，能较好地去除精液保存过程中的超氧阴离子，维持细胞表面双分子层的稳定性，从而减少精子保存过程中所遭受的氧化损伤，提高了精子质膜的完整性，从而改善精液质量。

生物体内的氧化性因素能够直接作用于精子细胞，使细胞内的Ca2+浓度迅速升高，引起ATP的严重不足，导致NADH、GSH、脂类等相关物质发生氧化以产生氧化应激，进而诱导精子细胞出现凋亡，而ROS作为氧化应激的标志物处于精子凋亡过程的中心信号位置。目前的研究表明，抗氧化剂能够有效的调节动物机体氧化还原平衡，减缓或抑制细胞内自由基的生成而减少氧化应激的产生，进而减少了因氧化应激引起的细胞凋亡。壳聚糖的抗氧化性可能是由于分子链上的活性氨基和羟基，而低分子质量壳聚糖与高分子质量壳聚糖相比具有更好的溶解性，使得活性官能团易于与自由基作用，且壳聚糖内含有大量氢键，高分子壳聚糖内氢键结合将对紧密，降低了氨基基团和羟基基团与外界反应的活性，而低分子质量壳聚糖结构相对松散，分子内氢键相对较弱。壳聚糖可能通过MAPK途径转导，c-Jun氨基末端激酶和细胞外信号调节激酶，抑制了激活蛋白，减缓机体抗氧化应激。这是因为壳聚糖增强体内清除多余自由基的能力，以维持自由基产生和清除的平衡，减少自由基引起的脂质过氧化反应，从而使MDA含量降低，起到保护猪精子的作用。然而，本试验中壳聚糖如何提升精液常温保存质量仍需进一步研究。