小麦近缘物种通用标记的开发及应用

刘占圣，郭军，韩冉，徐文竞，傅晓艺，刘任糠，潘凯琳，李豪圣，刘建军，汪晓璐，刘成

（1.山东省农业科学院作物研究所／农业农村部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室／小麦玉米国家工程实验室，山东 济南 250100；2.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005；3.石家庄市农林科学研究院，河北 石家庄 050049；4.江苏大学，江苏 镇江 212013）

小麦是世界上最重要的粮食作物之一。小麦近缘物种中含有丰富的抗病、抗逆和抗虫等优异基因，是改良小麦抗病、抗逆等性状的珍贵基因库［1-4］。将近缘植物与小麦杂交，创制小麦遗传改良材料是小麦远缘杂交的重要内容［5］。随着小麦远缘杂交和染色体工程研究的深入开展，含优异基因的外源染色体或染色体片段被导入小麦［6］，创制出了一大批优良的中间材料［7］，为丰富普通小麦的遗传基础和性状遗传改良提供了重要的物质基础。

分子标记是鉴定小麦远缘杂交种质的有效工具。在小麦近缘植物特异标记建立方面，刘旭等［8］利用RAPD引物对高大山羊草及对照进行分析，建立了可以用于检测小麦背景中高大山羊草染色体的RAPD标记。王春梅等［9］利用STS引物对中国春、黑麦、普通小麦-黑麦1R-7R二体异附加系进行分析，建立了黑麦1R染色体特异STS标记。Zhang等［10］根据小麦EST序列设计引物对小麦、簇毛麦以及小麦-簇毛麦渐渗系进行扩增，建立了簇毛麦5VS特异EST标记。Mattera等［11］利用EST引物对智利大麦和小麦等材料进行扩增，建立了智利大麦7Hch染色体EST标记。Liu等［12］利用一套小麦-拟斯卑尔脱山羊草附加系和代换系为材料，开发了拟斯卑尔脱山羊草S基因组染色体特异EST标记和SSR标记。

上述标记主要是建立某一小麦近缘物种特异标记，或者是建立小麦近缘物种某一条染色体（臂）特异分子标记［8-12］，但可用于同时区分不同小麦近缘物种的分子标记，以及可同时用于检测小麦背景中不同近缘物种的通用标记还未见报道。鉴于此，本研究通过筛选小麦A、B和D染色体共线性基因某一内含子三个亚基因组间长度差异超过10 bp的区域，在该内含子上下游的外显子保守序列处设计引物，利用小麦为对照，小麦近缘物种、小麦-近缘物种杂交种质为材料，进行PCR扩增，建立了能检测小麦近缘物种的通用标记，对筛选鉴定小麦外缘材料、小麦-外缘物种杂交种质、分离群体以及选育含外缘物种血缘的小麦品系（种）均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中国春（Chinese Spring，CS）、N-编号和A6-4材料由电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供。7047和15n-21由山西省农业科学院作物研究所张晓军研究员提供。XX030由英国约翰英纳斯中心Steve M Reader教授提供。济麦21、济麦22、济麦23、济麦44、济麦229和济麦262由山东省农业科学院小麦研究团队自主培育。PI编号材料由美国种质资源库Harold Bockelman博士提供。AE编号材料和NGB编号材料分别源自德国IPK和北欧遗传资源中心，由江苏大学何华纲教授引进并提供。TA编号材料由美国堪萨斯州立大学小麦遗传与资源中心Bernd Friebe教授提供，材料具体信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 序列分析与选择 利用BLASTN对中国春小麦参考基因组及其注释信息IWGSC RefSeq Annotation v1.0中的A∶B∶D＝1∶1∶1同源基因信息进行分析，保留微观共线性良好并且均来自相同同源群的基因（参数设置E-value≤1E-10），保留含有内含子并且A、B和D亚基因组之间相对应内含子大小差别均超过10 bp的基因。在上一步筛选出的内含子信息基础上，分别获取每个内含子上下游的外显子序列，长度小于50 bp外显子序列将被去除。

1.2.2 引物设计与合成 利用Primer 3（https://github.com／primer3-org／primer3）分别在上下游外显子序列中设计正向和反向PCR引物，PCR引物的长度范围19～23 bp。分别对每组内含子中A、B和D三个亚基因组的正向或反向引物去重，然后以组为单位分别统计正向或反向引物重复出现的次数，只保留重复次数为3，即在A、B和D三个亚基因组中均完全匹配的引物。利用BLASTN对上述引物进行整个基因组水平的特异性检测，数据库为中国春参考基因组TGAC v1.39，E-value设置为10，输出格式设置为6；保留BLASTN输出中100%匹配（匹配长度与引物长度相同）的结果，并统计每条引物匹配到基因组上的位置数目；只保留匹配位置数目为3的引物，即在每个亚基因组上有且只有唯一匹配的引物。利用BLASTN对上述引物在基因组上的位置进行检索，去除未知染色体（ChrUn）以及不能成对的引物（即只有正向或只有反向引物）。利用A基因组的序列信息，选取每个基因中PCR产物最小或正反向引物相距最近的组合。将设计的引物序列递交青岛擎科天成生物技术有限公司合成。

表1 试验材料

1.2.3 DNA提取及PCR扩增 基因组DNA的提取方法参照Liu等［13］，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取液的完整性和浓度。PCR反应体系（30μL）：DNA（25 ng／μL）2.0μL，Taq DNA polymerase（5 U／μL）0.3μL，dNTPs（200μmol／L）0.3μL，含Mg2＋的10×PCR buffer 3.0μL，上、下游引物（10μmol／L）各2μL，用无菌双蒸馏水补充反应体系至30μL。PCR扩增程序：94℃3 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃2 min，共35个循环；72℃10 min。4℃保存。

1.2.4 PCR产物电泳及检测 PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）电泳检测。PAGE每100 mL包括30%丙烯酰 胺 溶 液 （acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis，29∶1）20 mL，5×TBE缓冲液20 mL，10%过硫酸铵溶液（ammonium persulphate，AP）1 mL，四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）40μL，最后用无菌双蒸馏水补充至100 mL。电泳完后，PAGE在1μg／mL溴化乙锭溶液中染色30 min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下观察并拍照保存。

2 结果与分析

2.1 引物筛选与外缘物种通用标记的获得

通过生物信息学筛选，共获得符合要求的引物2 189对，随机选取并合成其中的36对，以济麦21、济麦22、济麦23、济麦44、济麦229和济麦262为材料，对其扩增效果进行筛选验证。结果发现，36对引物均能在供试小麦中扩增出相同的2～3条清晰DNA条带。其中，引物Triad＿24、Tri-ad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的扩增条带如图1所示。

为研究36对引物在小麦族物种间是否可以扩增出多态性，以中国春、野生一粒小麦、乌拉尔图小麦、黑麦、拟斯卑尔脱山羊草、沙融山羊草、高大山羊草、小伞山羊草、簇毛麦和智利大麦为研究材料进行PCR扩增，结果发现，36对引物中有25对可以在供试材料间扩增出明显多态性。这些引物不仅可以在同一物种不同亚种间扩增出多态性，还能在不同物种间扩增出多态性，因此，这些多态性标记可能可以应用于检测小麦背景的外源染色质。筛选出的25对引物信息如表2所示。引物Triad＿24、Triad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的扩增结果如图2所示。

图1 Triad＿24等6对引物在普通小麦中扩增产物的PAGE电泳检测图谱

图2 Triad＿24等6对引物在小麦近缘物种中扩增产物的PAGE电泳检测图谱

2.2 外缘物种通用标记的应用

为了验证筛选出的25对引物扩增出多态性标记在检测小麦背景的外源染色质的可行性，以中国春、硬粒小麦-簇毛麦双二倍体、小麦-长穗偃麦草双二倍体、小麦-中间偃麦草部分双二倍体（7047）、小麦-多年生簇毛麦附加系、小麦-非洲黑麦双二倍体、小麦-中间偃麦草部分双二倍体（15n-21）、中国春-智利大麦双二倍体、圆锥小麦-顶芒山羊草双二倍体、圆锥小麦-单芒山羊草双二倍体、小麦-偏凸山羊草部分双二倍体、乌拉尔图小麦-沙融山羊草双二倍体、栽培一粒小麦-二角山羊草、小麦-无芒山羊草双二倍体、中国春-希尔斯山羊草双二倍体和小麦-尾状山羊草双二倍体为研究材料进行PCR扩增，结果发现，25对引物都可以在供试材料间扩增出明显多态性。因此，这些多态性标记可以应用于检测小麦背景的外源染色质。引物Triad＿24、Triad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的扩增结果如图3所示。

图3 Triad＿24等6对引物在小麦远缘杂交种质中扩增产物的PAGE电泳检测图谱

表2 标记名称及引物

3 讨论与结论

小麦EST-SSR引物、SSR引物、STS引物和PLUG引物均可用于小麦近缘物种标记开发［14-20］。李 宏 伟［14］、李 飞［15］、陈 仕 勇［16］、徐鑫［17］和宿俊吉［18］等分别对小麦EST-SSR引物在小麦及近缘物种间遗传多样性、小麦和黑麦草间通用性、小麦和垂穗披碱草间通用性、小麦与长穗偃麦草间通用性、小麦与冰草间通用性进行了研究，认为部分引物可用于小麦近缘物种标记开发。徐鑫［17］、宿俊吉［18］、王黎明［19］、严学兵［20］等分别对小麦SSR引物在小麦与长穗偃麦草间通用性、小麦与冰草间通用性、小麦与中间偃麦草通用性、小麦与披碱草间通用性进行了研究，认为部分引物可用于小麦近缘物种标记开发。此外，徐鑫［17］还对小麦STS引物和PLUG引物在普通小麦和长穗偃麦草间的通用性进行了研究，认为部分STS引物和PLUG引物可以用于开发长穗偃麦草标记。上述研究均是利用其他已经发表文献为基础进行引物通用性研究，且所用小麦近缘物种为某一物种或某一属的较少几个物种。本研究通过自主筛选小麦A、B和D染色体共线性基因某一内含子三个亚基因组间长度差异超过10 bp的区域，在该内含子上下游的外显子保守序列处设计引物，对小麦族黑麦属、簇毛麦属、大麦属、偃麦草属、山羊草属等物种进行PCR扩增验证，建立了能检测小麦近缘物种的通用标记，为小麦近缘物种标记开发提供了新的研究思路。

不同类型引物在小麦近缘物种染色体特异标记开发效率方面，González等［21］利用RAPD引物开发黑麦染色体标记，开发效率为32.86%（46／140）。Liu［22］、刘晓明［23］、Gong［24］、Said［25］等分别利用EST-STS引物开发希尔斯山羊草、高大山羊草、尾状山羊草和大麦染色体特异标记，开发效率分别为13.89%（20／144）、5.00%（6／120）、3.66%（15／410）和9.09%（4／44）。Liu［22］、Said［25］、Zhao［26］等分别利用SSR引物开发高大山羊草、大麦和簇毛麦染色体特异标记，开发效率分别为12.50%（2／16）、12.90%（8／62）和2.44%（2／82）。Gong等［24，27］分别利用COS引物开发尾状山羊草和希尔斯山羊草染色体特异标记，开发效率分别为3.74%（4／107）和3.61%（3／83）。Gong［24，27］、Liu［28，29］等分别利用PLUG引物开发尾状山羊草、希尔斯山羊草、无芒山羊草、顶芒山羊草染色体特异标记，开发效率分别为12.43%（23／185）、5.00%（3／60）、8.97%（13／145）和8.94%（47／526）。RAPD引物扩增效果非常不稳定［30］，近十年来在小麦族物种研究中已被基本弃用。其它引物如SSR、COS和PLUG等对不同小麦近缘物种染色体特异标记开发效率从2.44%～13.88%不等。本研究利用新开发的内含子扩增引物对小麦族不同物种进行扩增，开发标记的比例为69.44%（25／36），显著高于上述研究，因而，该方法可广泛应用于小麦近缘物种染色体特异标记建立研究。

致谢：感谢山东农业大学倪飞教授和山东省农业科学院作物研究所张荣志副研究员在生物信息学分析方面给予的大力帮助，感谢江苏大学何华纲在PAGE电泳技术中给予的指导和帮助。