HIV/AIDS患者外周血单个核细胞中微小RNA-191和微小RNA-21的表达水平及其临床意义▲

徐玉萍 王继业 田 群

(1 桂林医学院卫生所，广西桂林市 541004，电子邮箱：1121886678@qq.com；2 桂林市第二人民医院呼吸与危重症医学科，广西桂林市 541001；3 桂林市第三人民医院感染病科，广西桂林市 541001)

HIV感染分为急性期、无症状期和AIDS期，当患者进入AIDS期时，病情发展迅速，生命健康受到严重威胁[1]。鉴于AIDS的危害性，世界各国的卫生系统制定了相关政策、措施来预防和治疗AIDS，虽然目前已经取得瞩目的成绩，但由于无法根治且容易在易感人群中传播，AIDS仍未得到有效的控制，AIDS防治仍是全球公共卫生面临的重要挑战之一[2-3]。当前缺乏特效治疗药物是AIDS死亡率高的根本原因，研究显示，抗反转录病毒疗法是一种有效抑制病毒复制的治疗方法，可大大提高患者的生存质量[4]，但该疗法仅仅作用于主动复制的病毒，并不能根除潜伏的病毒。随着近年来对HIV的研究不断深入，越来越多证据表明人体内微小RNA(microRNA，miRNA)与HIV复制密切相关[5-6]。目前国内未见关于HIV感染患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中 miRNA-191、miRNA-21的表达与HIV载量相关性的研究。本研究旨在分析HIV感染或AIDS患者(HIV/AIDS患者)PBMC中 miRNA-191、miRNA-21的表达水平与HIV载量的关系，初步探讨miRNA-191和miRNA-21作为AIDS患者诊疗靶点的可能性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月至2019年1月在桂林市第三人民医院治疗的63例HIV感染者和25例AIDS患者作为研究对象，选取同时期在该院进行健康体检的50例健康者作为对照组，其中HIV感染者和AIDS患者的诊断符合《艾滋病诊疗指南第三版(2015版)》[7]中的相关标准。3组研究对象的纳入标准：(1)年龄18岁以上，具有完全民事行为能力；(2)HIV感染者和AIDS患者感染的HIV类型为HIV-1；(3)对本次研究内容知情并愿意配合研究，自愿签订知情同意书。排除标准：(1)合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等可能影响miRNA表达的疾病者；(2)孕妇、哺乳期、精神病或抑郁症患者。3组研究对象的性别、年龄、文化程度、婚姻状况、传播途径等一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究符合道德伦理要求，已通过桂林市第三人民医院医学伦理委员会审查。

表1 3组研究对象的一般资料的比较

1.2 PBMC的分离及培养 采集患者晨起空腹肘静脉血5 mL，转入50 mL离心管中，加入5 mL磷酸缓冲盐溶液(上海远慕生物科技有限公司，批号：s20190907)稀释，轻轻混匀。取两支15 mL离心管，先加入5 mL Ficoll溶液(上海创赛科技有限公司，批号：20190624)，然后将5 mL稀释的血液轻轻加入离心管的Ficoll溶液上层，离心机2 000 r/min离心20 min。用吸管将白色细胞层细胞吸取至另一干净的10 mL离心管中，加入磷酸缓冲盐溶液至5～10 mL，1 500 r/min离心10 min后去掉上清。用密度梯度离心法分离单个核细胞，将单个核细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(上海逍鹏生物科技有限公司，批号：LX190421)，接种于25 mL培养瓶中，在37℃、5% CO2的条件下贴壁孵育6 h，收集贴壁细胞即为单核细胞，用吉姆萨染色，取细胞纯度大于85%者用于提取总RNA。

1.3 健康正常人和HIV/AIDS患者之间表达差异miRNA的筛选 采用随机数字表法选取上述研究对象中的3例健康人群、3例HIV感染者和3例AIDS患者作为基因芯片检测对象，筛选差异表达miRNA。将提取的组织总RNA进行靶标制备，对miRNA芯片进行了RNA标记和杂交。使用mirVana miRNA分离试剂盒(美国Ambion公司，产品批号：KGS512)纯化100μg总RNA，获得miRNA。用Cy3(美国ChemeGen 公司，产品批号：1010386-62-5)标记纯化后的miRNA，在miRNA芯片(Agilent Technologies公司)上进行杂交，与939个人类miRNA基因比对。应用miRNA芯片分析系统(Agilent Feature Extraction v10.7, Agilent Gene Spring软件)P-value法对基因芯片杂交结果进行分析。按如下标准筛选差异表达miRNA，其中|log2变化倍数|≥6为上调基因；|log2变化倍数|≤-2为下调基因。miRNA表达谱基因芯片为由北京博奥生物有限公司提供的Agilent基因芯片。

1.4 血浆HIV病毒载量的检测 收集88例HIV/AIDS患者血液样本，3 000 r/min离心15 min，分离血浆保存于医用-4℃冰箱中备用，取1 mL患者血浆置入S-tube管中，利用实时荧光定量PCR(探针法)检测血浆病毒载量，TaqMan全自动病毒载量仪购自Roche公司，检测试剂盒为HIV-1 Testv2.0(广州市鸿洲实验器材科技有限公司，批号：1812045003)。以HIV/AIDS患者病毒载量水平的中位数为临界值，分为病毒载量低水平组和病毒载量高水平组。

1.5 PBMC中 miRNA-191、miRNA-21的检测 使用胰蛋白酶消化PBMC后，使用TRIzol法提取细胞总RNA，采用微量分光光度计检测总RNA纯度，再使用一步法反转录试剂盒(上海一研生物有限公司，批号：20181128)将RNA反转录为cDNA，将cDNA按1 ∶1 000比例稀释后，使用U6作为内参基因进行实时荧光定量PCR反应，PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司(型号：iCycler)，miRNA引物均由广州市锐博生物科技有限公司合成。反应体系总体积20 μL，其中SYBR Green 10 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL、上游引物1 μL和下游引物1 μL。反应条件：94℃ 3 min；95℃ 45 s；62℃ 30 s；72℃ 60 s，共35个循环。miRNA-191上游引物为5′-GCUGCGCUUGGAUUUCGUCCCC-3′，下游引物为5′-CAACGGAATCCCAAAAGC-3′；miRNA-21上游引物为5′-CCGCTCGAGGGTAGGAGG-3′，下游引物为5′-GCTAGACCTCTGGGCCTC-3′;U6上游引物为5′-GC-CAACGTCAGTAGGCAGA-3′，下游引物为5′-GCCAAC-CATGATCTGCTGAAAC-3′。采用2-ΔΔCt法分析miRNA的相对表达水平。

1.6 统计学分析 利用SPSS 22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用成组设计t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t法；不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M(P25,P75)]表示，两组间比较采用Mann-Whitneyu检验，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，两两比较采用Tamhane′s T2检验。采用Pearson检验分析双变量的相关性；采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析miRNA-191与miRNA-21预测HIV急性感染期和AIDS期的价值。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 健康正常人和HIV/AIDS患者PBMC中差异表达的miRNA 基因芯片检测结果显示，健康正常人和HIV/AIDS患者间共有10组miRNA的表达水平存在差异，见图1。其中，hsa-miRNA-191、hsa-miRNA-23a、hsa-miRNA-146a、hsa-miRNA-31、hsa-miRNA-29a、hsa-miRNA-34这6种基因在HIV/AIDS患者中表达下调，以hsa-miRNA-191下调程度最高；hsa-miRNA-21、hsa-miRNA-423、hsa-miRNA-15a、hsa-miRNA-205这4种基因在HIV/AIDS患者中表达上调，其中hsa-miRNA-21上调程度最高。故选取高度差异的 miRNA-191和miRNA-21作为研究的miRNA。

图1 健康正常人和HIV/AIDS患者PBMC中miRNA的表达差异

2.2 HIV/AIDS患者与健康正常人PBMC中miRNA-191和miRNA-21表达水平的比较 与健康正常人比较，急性感染期、无症状期HIV感染者和AIDS患者PBMC中的miRNA-21相对表达水平升高，而miRNA-191相对表达水平降低(均P<0.05)；与无症状期HIV感染者比较，急性感染期HIV感染者和AIDS患者PBMC中的miRNA-21相对表达水平升高，而miRNA-191相对表达水平降低(均P<0.05)。见表2。

表2 HIV/AIDS患者与健康正常人PBMC中miRNA-191和miRNA-21相对表达水平的比较(x±s)

2.3 不同临床特征HIV/AIDS患者的病毒载量及PBMC中miRNA-191、miRNA-21表达水平的比较 不同性别、年龄HIV/AIDS患者的病毒载量及PBMC中 的miRNA-191、miRNA-21相对表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。与低水平病毒载量HIV/AIDS患者比较，高水平病毒载量HIV/AIDS患者的病毒载量和miRNA-21相对表达水平升高，miRNA-191相对表达水平降低(均P<0.05)；与无症状期HIV感染者比较，急性感染期HIV感染者和AIDS患者的病毒载量升高(均P<0.05)。见表3。

表3 不同临床特征HIV/AIDS患者病毒载量及PBMC中miRNA-191、 miRNA-21相对表达水平的比较(x±s)

2.4 HIV/AIDS患者病毒载量与PBMC中miRNA-191、miRNA-21表达水平的相关性 HIV/AIDS患者的病毒载量与PBMC中的miRNA-191表达水平呈负相关(r=-0.482，P<0.001)，与miRNA-21表达水平呈正相关(r=0.247，P=0.020)。

2.5 HIV/AIDS患者PBMC 中miRNA-191与miRNA-21表达水平预测HIV急性感染期和AIDS期的价值 ROC曲线分析结果显示，以约登指数最大时为临界点，miRNA-191和miRNA-21最佳临界值分别为0.805和1.125，其对应的曲线下面积分别为0.794(95%CI：0.700～0.888；P<0.001)和0.685(95%CI：0.569～0.800；P<0.001)，提示miRNA-191与miRNA-21对HIV急性感染期和艾滋病期具有一定的预测价值。其中miRNA-191预测HIV急性感染期和AIDS期的灵敏度为65.2%，特异度为83.3%；miRNA-21预测HIV急性感染期和AIDS期的灵敏度为64.3%，特异度为76.1%。见图2和图3。

图2 miRNA-191预测HIV急性感染期和AIDS期的ROC曲线

图3 miRNA-21预测HIV急性感染期和AIDS期的ROC曲线

3 讨 论

HIV-1是一种反转录病毒，人体感染HIV-1后可迅速结合细胞膜上的CD4分子，感染CD4+T淋巴细胞，使CD4+T淋巴细胞数量逐渐减少，导致机体免疫功能障碍，最终导致AIDS的发生[8]。近年来学者对HIV的研究不断深入，越来越多的研究证实miRNA在HIV感染中扮演重要角色。miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，可特异性结合靶基因mRNA的非编码区以促进或抑制靶蛋白的翻译，从而调控蛋白质编码基因的表达，进一步影响其生物学功能[9]。miRNA与机体各项生理功能和病理过程密切相关[10]。HIV进入宿主细胞后，在细胞内大量复制，在复制过程中病毒基因与宿主基因发生复杂的作用。miRNA为广泛分布在宿主体内的基因，其可以通过直接作用于HIV转录本或病毒复制相关的周期蛋白来影响HIV复制。Modai等[11]的研究认为miRNA可通过抑制Dicer1、HIV-1 Rev结合蛋白和HIV-EP2的表达来抑制病毒复制；王莉彦等[12]的研究认为miRNA-29a可以直接作用于HIV转录本，抑制其转录及新病毒的产生。

本研究基因芯片检测结果显示，健康正常人与HIV/AIDS患者之间有10个差异表达的miRNA，其中HIV/AIDS患者的PBMC中有6种miRNA表达水平下调，仅有4种miRNA表达水平上调，提示miRNA表达差异对HIV有直接或间接的抑制或促进效应[13]。本研究中，HIV/AIDS患者的miRNA-191表达水平下调，而miRNA-21表达水平上调(均P<0.05)，后续定量分析结果与基因芯片检测结果趋势相同，故探讨HIV与miRNA-191、miRNA-21的关系具有重要意义。miRNA-191是新近发现的一种长度约为22nt的miRNA，在乳腺癌[14]、子宫内膜癌[15]、骨肉瘤[16]等多种不同疾病中的表达存在差异，但目前关于miRNA-191与HIV相关性的研究不多。本研究结果显示，HIV/AIDS患者的miRNA-191表达水平低于健康正常人，且急性感染期HIV感染者和AIDS患者的表达水平低于无症状期患者HIV感染者(均P<0.05)，提示miRNA-191可能是抑制HIV病情发展的保护因素。王莉彦等[12]的研究显示，过表达hsa-miRNA-191-5p有可能通过借助靶标核孔蛋白50和(或)C-C基序趋化因子受体1来实现抑制HIV复制的目的，与本研究结果相似。

研究显示，血清中循环miRNA-21在HIV感染人群和HIV未感染人群中的表达差异具有统计学意义[17]。本研究结果显示，HIV/AIDS患者的miRNA-21表达水平高于健康正常人，而急性感染期HIV感染者和AIDS患者的miRNA-21表达水平高于无症状期HIV感染者(均P<0.05)，与上述研究结果相似，提示过表达miRNA-21可能是HIV感染发展的危险因素。miRNA-21是单核细胞中γ-干扰素诱导蛋白10的重要调节因子，通过调节单核细胞分泌γ-干扰素诱导蛋白10来活化和促进炎症，而这些炎症的活化与HIV感染进展相关[18]。本文以HIV/AIDS患者病毒载量水平的中位数为临界值，将HIV/AIDS患者分为病毒载量高水平组和低水平组，进一步观察两组间miRNA-191和miRNA-21相对表达水平的差异。结果显示，低水平和高水平病毒载量HIV/AIDS患者之间的miRNA-191和miRNA-21相对表达水平差异具有统计学意义(均P<0.05)；双变量相关分析结果显示，miRNA-191表达水平与HIV病毒载量呈负相关，miRNA-21表达水平与HIV病毒载量呈正相关(均P<0.05)。这提示miRNA-191表达水平上调可以抑制HIV复制，而miRNA-21表达水平上调增加了HIV复制量。

众所周知，急性感染期HIV感染者和AIDS患者体内的HIV大量复制，因此这两个临床分期患者病毒载量较无症状期大大提升，本研究观察到不同临床分期患者中miRNA-191、miRNA-21的表达水平与病毒载量水平趋势相似，且ROC曲线分析显示，miRNA-191和miRNA-21表达水平对急性感染期和AIDS期均有较好的预测价值。因此，miRNA-191和miRNA-21表达或可作为预测HIV急性感染期和AIDS期的临床指标。

综上所述，HIV/AIDS患者PBMC中 miRNA-191和miRNA-21的表达与HIV病毒复制相关，且两者对HIV急性感染期和AIDS期患者具有较好的预测价值，有望成为HIV/AIDS患者诊疗的新靶点。