口虾蛄肌肉与副产物脂质特征分析

于 卓 良，李 德 阳，阴 法 文,2，周 大 勇,2

(1.大连工业大学 食品学院,辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心,辽宁 大连 116034)

0 引 言

口虾蛄(Oratosquillaoratoria)作为甲壳纲、口足目动物的代表物种，在我国沿海水域广泛分布[1]。口虾蛄风味独特，并富含蛋白质、磷、微量元素以及人体必需氨基酸，营养价值高[2]。在虾类的加工过程中，占整虾质量45%～60%的副产物被浪费或者低效利用[3]。为了减少环境污染，提高加工产业的经济效益，近几年来关于各种甲壳类动物副产物中蛋白质(肽)、壳聚糖及虾青素的开发利用研究常被报道[4-7]。

海洋虾类脂质中富含n-3 PUFA[8]，尤其是二十碳五烯酸(EPA，20：5n-3)和二十二碳六烯酸(DHA，22：6n-3)，在人类营养、疾病预防和保健中起着至关重要的作用[9-10]。食品中的n-3 PUFA主要以甘油三酯(TAG)和磷脂(PL)形式存在。与TAG型n-3 PUFA相比，PL型的n-3 PUFA因具有更高的生物利用度、组织输送能力和生物活性而受到越来越多的关注[11-12]。研究表明，口虾蛄脂质中富含n-3 PUFA[13]，然而对于其可食部位以及副产物中磷脂分子种类的详细描述尚未见报道。

本研究主要表征口虾蛄肌肉和副产物的脂质特征，包括脂质质量分数、虾青素质量分数、脂质组成、磷脂组成、脂肪酸组成以及磷脂分子种等脂质信息，为深入揭示口虾蛄的营养价值以及口虾蛄加工副产物的开发利用前景提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

新鲜口虾蛄(Oratosquillaoratoria)，30～35只/kg，雌雄各半，无子，大小均一，大连新长兴水产品市场；甘油磷脂标准品，美国Avanti Polar Lipids公司；甲醇、氯仿、乙腈、正己烷、二氯甲烷等，色谱级，美国Spectrum Chemical公司；氘代氯仿、氘代甲醇、磷酸三乙酯、碳酸铯、重水，上海阿拉丁试剂有限公司；其他分析级试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

2KBTES-55冷冻干燥机，美国VirTis公司；Iatroscan MK-6S棒状薄层色谱-氢火焰离子化检测器，日本Iatron公司；Avance Ⅲ 400MHz Bruker核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；Agilent 7890A气相色谱串联5977A质谱检测器，美国Agilent公司；Shimadzu LC-20AD高效液相色谱串联SPD-M20A DAD检测器，日本Shimadzu公司；API 4000 Qtrap三重四极杆线性离子阱(QqLIT)质谱仪，美国AB Sciex公司。

1.3 方 法

1.3.1 样品处理

将3 kg口虾蛄手工分为肌肉与副产物(头部、甲壳和尾部)两部分后冷冻干燥72 h，经高速粉碎机粉碎后得到口虾蛄肌肉和副产物干粉，真空密封后在-30 ℃冰箱中冷藏备用。

1.3.2 总脂提取

根据Blight等[14]的方法，分别提取口虾蛄副产物与肌肉干粉的总脂，在-80 ℃下贮藏，并在两周内用以分析检测。

1.3.3 脂质组成分析

采用MK-6S棒状薄层色谱-氢火焰离子化检测器(TLC-FID)对脂质组成进行测定[15]。检测参数：氢气体积流量160 mL/min，空气体积流量2 L/min，扫描速度每根色谱棒30 s，利用分析软件采用归一化方法计算各组分相对质量分数。

1.3.4 脂肪酸分析

采用GC-MS联用仪，配置HP-5-MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)对脂肪酸组成和相对质量分数进行测定[15]。载气为氦气，压力保持在48.95 kPa。进样量1 μL，分流比50∶1。MS条件为EI源(70 eV)，溶剂延迟4 min。脂肪酸甲酯通过比较保留时间，标准品和NIST08质谱数据库来鉴定，并通过峰面积归一化计算脂肪酸相对质量分数。

1.3.5 磷脂组成分析

采用核磁共振波谱仪(31P-NMR)检测磷脂类组成[16]，使用MestReNova 6.1.1软件对各磷脂成分的峰进行积分。利用积分后峰面积与标准品对比，通过归一化对磷脂组成进行量化得到摩尔分数。

1.3.6 虾青素质量分数的测定

采用LC-SPD对虾青素质量分数进行测定[17-18]，配置C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm)。梯度洗脱分两相进行：体积比85.0∶5.0∶4.5∶5.5的甲醇、二氯甲烷、水、乙腈溶液A；体积比28.0∶22.0∶4.5∶45.5的甲醇、二氯甲烷、水、乙腈溶液B。洗脱程序：0～8 min，不加溶液B；8～32 min，0～100%溶液B；进样量10 μL；总体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；在220～650 nm范围内进行三维色谱分析；测定虾青素所用波长为484 nm，虾青素保留时间由虾青素标准品光谱决定。虾青素峰面积计算公式：

A=A1+1.1A2+1.3A3

式中：A1、A2、A3分别为样品溶液中反式虾青素、9-顺式-虾青素和13-顺式-虾青素的峰面积响应值，1.1和1.3为9-顺式-虾青素和13-顺式-虾青素对反式虾青素的相对响应系数。

1.3.7 甘油磷脂分子种分析

根据文献[19-21]的方法，采用装配了Turbo V电喷雾电离源(ESI)质谱仪进行甘油磷脂分子种的定性和定量分析，使用HPLC-MS分析软件1.6.1进行数据处理。

1.3.8 数据统计与分析

所有实验重复3次，数据采用SPSS 16.0软件进行分析。结果用(平均值±标准差)(SD)表示，采用单因素方差分析评价平均值之间的差异，P<0.05为差异有统计学显著性意义。

2 结果与讨论

2.1 脂质特征的分析

2.1.1 脂质质量分数、虾青素质量分数及脂质组成

由表1可见，冻干口虾蛄肌肉中的脂质质量分数明显高于副产物，脂质中虾青素(AST)质量分数明显低于副产物。在其他品种虾中也发现这种特征[8，22]。从肌肉和副产物中提取的脂质由磷脂(PL)、甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、单甘油酯(MAG)、胆固醇(CHO)、游离脂肪酸(FFA)组成。其中PL质量分数最高，TAG和CHO次之。与肌肉脂质相比，副产物脂质中的PL和CHO质量分数略高，而TAG质量分数略低。前期研究结果表明，PL在斑结竹对虾(Penaeusmonodon)和凡纳滨对虾(Litopenaeusvanname)的脂质组成中质量分数最高[23-25]，而在Penaeusmonodon和雄性北极甜虾(Pandalusmontagui)脂质中有与口虾蛄相似的CHO质量分数[24，26]。

表1 口虾蛄肌肉和副产物干基的脂质质量分数、虾青素质量分数及脂质组成Tab.1 Lipid content,astaxanthin content and lipid class compositions from two parts of Oratosquilla oratoria %

2.1.2 磷脂组成

由表2可见，口虾蛄肌肉和副产物中均检测到磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)。其中，PC和PE是肌肉及副产物PL的主要成分。之前的研究结果也显示，海洋虾类磷脂包含PC、PE、PS、PI、LPC[27-28]。其中，Penaeuskerathurus肌肉和头部的磷脂中PC与PE的质量分数与本研究结果相近。不同种类的PL其极性头部不同，营养价值也不同。

表2 口虾蛄肌肉和副产物的磷脂类组成的摩尔分数Tab.2 Molecular fractions of phospholipids (mole fraction) in muscle and by-products recovered from different parts of Oratosquilla oratoria %

2.1.3 脂肪酸组成

由表3可见，口虾蛄脂质中多不饱和脂肪酸(PUFA)质量分数最高，尤其是EPA和DHA。其中，口虾蛄副产物脂质的多不饱和脂肪酸所占总脂肪酸比例显著高于肌肉。口虾蛄脂质中单不饱和脂肪酸(MUFA)质量分数皆高于饱和脂肪酸(SFA)。Balzano等研究了虾蛄可食部的脂肪酸组成，结果表明，PUFA占总脂肪酸质量分数为(40.19±3.37)%，是虾蛄可食部的主要脂肪酸，与本研究结果相似[13]。可见，口虾蛄副产物是一种容易被忽视的n-3 PUFA来源，具有潜在的开发价值。

表3 口虾蛄肌肉和副产物脂质中的脂肪酸组成Tab.3 Fatty acid compositions of the lipids recovered from different parts of shrimps Oratosquilla oratoria %

2.2 口虾蛄副产物和肌肉的甘油磷脂分子种特征

使用三重四极杆质谱基于正离子模式下选择离子扫描鉴定口虾蛄两部分脂质的甘油磷脂(GPL)分子种，如图1所示。通过m/z=184的母离子扫描(PIS)选择性检测甘油磷脂酰胆碱(GPCho)和溶血甘油磷脂酰胆碱(LGPCho)的甘油磷脂分子种(图1(a))，而甘油磷脂酰乙醇胺(GPEtn)/溶血甘油磷脂酰乙醇胺(LGPEtn)以及甘油磷脂酰丝氨酸(GPSer)/溶血磷脂酰丝氨酸(LGPSer)则分别通过选择m/z=141和185的中性丢失扫描选择性鉴定其分子种(图1(b)、(c))。甘油磷脂分子种通过特征性扫描得到一阶质谱信息。根据之前推导的公式，可以推导出GPL中酯化FA的碳原子和双键的总数，并通过二级质谱扫描，推测sn-1和sn-2位置上FA的具体结构信息，同时对缩醛甘油磷脂(磷脂酰醚酯和磷脂酰烯醇酯)进行结构鉴定[19-21]。此外，以正离子模式下的甘油磷脂的一阶质谱信号强度与相应内标的信号强度之比来表示其相对的比较量。

(a) 一级质谱m/z=184

口虾蛄肌肉和副产物的主要甘油磷脂分子种测定结果见表4。在肌肉和副产物脂质中分别检测到97和102种分子种，其中包括GPCho、GPEtn、GPSer、LGPCho、LGPEtn和LGPSer。在口虾蛄肌肉和副产物脂质的GPCho、GPEtn、GPSer中，16：0/20：5、18：0/20：5、16：0/22：6、18：0/22：6、20：4/20：5、14：0/20：4等是磷脂酰酯的主要分子种，18：4/18：0、20：1/18：0等可能是磷脂酰醚酯的主要分子种，16：0/16：0、18：3/18：0、20：0/18：0等可能是磷脂酰烯醇酯的主要分子种。Balzano等[13]报道Penaeuskerathuru的PC富含PUFA，尤其是EPA。本研究也发现口虾蛄肌肉和副产物中也含有丰富的缩醛磷脂。以往的研究也表明，鱼类、贝类、甲壳类等海产品中脂质的缩醛磷脂质量分数丰富[29]。

表4 口虾蛄肌肉和副产物脂质中的主要甘油磷脂分子种Tab.4 Major glycerophospholipids in muscle and by-product lipids of Oratosquilla oratoria

续表

3 结 论

口虾蛄肌肉干基的脂质质量分数明显高于副产物，而虾青素质量分数在口虾蛄副产物脂质中比肌肉中更高，分别为(2.09±0.08)和(0.9±0.01)μg/g。总脂质由TAG、DAG、MAG、PL、FFA、CHO组成，其中PL最高，占总脂质质量分数61.57%～73.60%；TAG和CHO次之，与肌肉相比副产物脂质中的PL和CHO占比更高，TAG占比较低。口虾蛄磷脂以PC和PE为主，摩尔分数分别为55.54%～61.11%和30.79%～24.86%，并且含有少量的PI、PS、LPC。PUFA是口虾蛄脂质的主要脂肪酸，以EPA和DHA为主，分别占总脂肪酸质量分数12.37%～15.06%和13.89%～13.99%。检测到口虾蛄副产物和肌肉中大约200个甘油磷脂分子种，其中主要分子种富含EPA和DHA。可见，口虾蛄脂质的营养价值较高，而口虾蛄副产物作为磷脂型n-3 PUFA的来源，具有潜在的开发价值。