联氨基姜黄素诱导DC细胞成熟抑制小鼠皮肤鳞癌进展的机制研究

尤其　　郭辉　　孔凡慧　　王冬梅

[摘要] 目的 研究聯氨基姜黄素诱导DC细胞成熟抑制小鼠皮肤鳞癌进展的机制。 方法 梯度浓度（1/5/10/50/100/500 μM）的联氨基姜黄素处理SCC细胞系SCL-1 48 h，MTT检测细胞活性。同时构建自发性SCC小鼠模型，给予药物处理观察肿瘤进展情况，流式检测肿瘤组织树突状成熟状态。Western blot检测联氨基姜黄素处理前后树突状细胞STAT3通路的变化。 结果 不同浓度的联氨基姜黄素在处理SCC细胞系SCL-1的过程中可能会对细胞的活性产生抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05）。 半数最大抑制浓度值（IC50）为18.7 μM。正常C57BL/6小鼠在为期2周的肠胃给药处理以后，通过与对照组进行比较发现其体重的变化并不显著。自发性SCC小鼠模型在接受联氨基姜黄素处理后，抗肿瘤的效果较为突出，差异有统计学意义（P<0.05）。流式检测SCC小鼠的肿瘤组织，发现联氨基姜黄素处理可促进树突状细胞成熟（CD80/CD86明显上调），差异有统计学意义（P<0.05）。进一步Western blot检测联氨基姜黄素处理前后树突状细胞 STAT3通路发现处理组 STAT3磷酸化水平显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 联氨基姜黄素可在体外杀伤SCC细胞，并在体内促进树突状细胞成熟进而抑制SCC进展，其可能的机制是通过抑制 STAT3磷酸化，抑制STAT3通路。

[关键词] 联氨基姜黄素;皮肤鳞状细胞癌;增殖;树突状细胞;STAT3

[中图分类号] R739.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）12-0039-04

Study on the mechanism of DC maturation induced by hydrazinocurcumin in inhibiting mouse skin squamous cell carcinoma

YOU Qi1   GUO Hui2   KONG Fanhui1   WANG Dongmei3

1.Department of Clinical Laboratory， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou   310012， China; 2.Special Service Center of the Air Force in Hangzhou， Hangzhou   310013， China; 3.Department of Dermatology， Zhejiang Provincial Tongde Hospital， Hangzhou   310012， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of DC maturation induced by hydrazinocurcumin in inhibiting mouse skin squamous cell carcinoma. Methods SCC cell line SCL-1 was treated with hydrazinocurcumin at gradient concentration（1/5/10/50/100/500 μM） for 48 h， and cell activity was determined by MTT. At the same time， the spontaneous SCC mouse model was constructed， the tumor progression was observed after drug treatment. The dendritic maturation state of tumor tissues was detected by flow. The changes of STAT3 pathway in dendritic cells before and after treatment with hydrazinocurcumin were observed by Western blot. Results Different concentrations of hydrazinocurcumin may inhibit the activity of cells in the treatment of SCC cell line SCL-1， and the difference was significant（P<0.05）. The median maximum inhibitory concentration（IC50） was 18.7 μM. After normal C57BL/6 mice were given gastrointestinal administration of the drug for two weeks， their weight did not change significantly when compared with the control group. After treatment with hydrazinocurcumin， the antitumor effect of spontaneous mouse model was more prominent， and the difference was significant（P<0.05）. Flow cytometry detection of tumor tissues in SCC mice showed that treatment with hydrazinocurcumin could promote dendritic cell maturation（CD80/CD86 was significantly up-regulated）， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Further Western blot analysis of the STAT3 pathway in dendritic cells before and after treatment with hydrazinocurcumin showed that the STAT3 phosphorylation level in the treatment group was significantly down-regulated（P<0.05）. Conclusion Hydrazinocurcumin can kill SCC cells in vitro and promote the maturation of dendritic cells in vivo， thus inhibiting the progression of SCC. The possible mechanism is to inhibit the STAT3 pathway by inhibiting the STAT3 phosphorylation.

[Key words] Hydrazinocurcumin; Cutaneous squamous cell carcinoma; Proliferation; Dendritic cell; STAT3

姜黄的活性成分为姜黄素，其为一种被广泛应用于疾病治疗的植物化合物[1，2]。联氨基姜黄素（Hydrazinocurcumin）的药理性更为显著，因此，可大大提升生物的利用程度[3]。前期研究证明HC是STAT3磷酸化的有效抑制剂。它可以下调一系列STAT3下游靶标，从而在体外抑制细胞增殖，集落形成丧失，抑制细胞迁移和侵袭以及诱导细胞凋亡[4-6]。然而HC对于肿瘤免疫微环境的调节少有讨论。本研究探讨HC对于皮肤鳞状细胞癌（Skin squamous cell carcinoma，SCC）小鼠模型成瘤的抑制作用，观察其对肿瘤生长以及肿瘤组织中树突状细胞（Dendritic cell，DC）成熟水平影响，并进一步研究其分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂

DMEM培养基、双抗、胎牛血清购自 Gbico（美国），流式抗体 Zombie、PE-CD80、 APC-CD86、FITC-CD11 c购自Becton Dickinson（美国），二抗购自Invitrogen（美国），一抗（anti-STAT3、anti-p-STAT3）、增强型发光试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology（美国），内参GAPDH购自 Abclonal（中国），PVDF膜购自Millipore（美国），rmGM-CSF、IL-4、 DMBA、TPA、丙酮溶液均购自Sigma（美国），DMSO、MTT试剂盒从武汉谷歌生物公司购入。酶联免疫检测仪为美国Thermo公司产品（IED0501003M），流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品（LSRFortessa）。

1.2 细胞培养和联氨基姜黄素处理

SCL-1细胞源自于上海中科院的细胞库，DMEM+10胎牛血清在5%CO2的条件下培育。DMSO配制的联氨基姜黄素浓度不一，针对所采集的细胞标本，将细胞悬液的浓度调配为5万/mL。在MTT实验中，将每个孔注入100 μL细胞悬液，之后再结合MTT实验流程和要求，在不同的小组内再分别设立6个复孔，通过相关的检测仪来判断细胞是否有活性。

1.3 小鼠骨髓树突状细胞提取和HC处理

对于C57BL/6小鼠采用颈椎脱位法将其致死，在无菌的环境下将其股骨和胫骨取出，然后吸取1X的PBS溶液，用胰岛素针从骨干的一端扎入骨髓腔，并将骨髓冲洗到器皿内。每根骨头的冲洗次数为4～6次。将器皿中的骨髓液集中起来进行离心操作，紧接着再添加红细胞裂解液，容量为5 mL。配制DMEM+rmGM-CSF（10 ng/mL）+IL-4（10 ng/mL）培养基培养裂红后细胞沉淀。将细胞培养板置于室温为37℃且含5% CO2的孵箱环境中进行培养，对于培养液则每间隔2.5 d换置1次。提供为期1周的rmGM-CSF。除外，PBS或10 μM HC处理24 h。

1.4 SCC小鼠模型构建

采用国际上通用的两步致癌法建立SCC小鼠模型。取5～6周C57BL/6小鼠20只，清除背部毛发待用。将 DMBA和TPA溶于丙酮配成母液，使用时DMBA浓度为 250 ng/μL，TPA濃度为50 ng/μL。用移液枪向小鼠背部的剃毛区涂抹200 μL浓度为250 ng/μL的DMBA溶液，DMBA将作为肿瘤诱变剂，引起小鼠皮肤基因的突变。1周后，用同样方法在每只小鼠的相同部位涂200 μL浓度为50 ng/μL的TPA溶液，TPA每周以相同剂量涂抹2次，共需涂抹20周。为保证小鼠背部对药物的充分吸收，每次涂药之前都应该尽量将小鼠新长出的毛发剃除干净，且每次涂药位置相同。处理组在TPA溶液涂抹3 d后，给予联氨基姜黄素干预，给药量相当于临床用药的等效剂量（联氨基姜黄素80 mg/kg），每天用药次数为1次，坚持20周。每天将用药后小鼠的变化情况如实记录。

1.5 联氨基姜黄素体内毒性验证

选取10只正常的C57BL/6小鼠，然后将其细分为两组，一是对照组，二是处理组，对于后一组则持续用药2周，每天将小鼠的体重变化情况予以如实记录。

1.6 肿瘤组织树突状成熟水平检测

分别从对照组和处理组中取小鼠的肿瘤组织，然后加以研磨，并进行低速离心5 min。基于实际状况来决定是否有必要处理裂解的红细胞。计数以后，用适量PBS研配单细胞悬液。将流式管做好标记，分别将50 μL肿瘤组织研磨成的单细胞悬液转移到流式管中。分别标记抗体Zombie、FITC-CD11c、PE-CD80、PE-CD86，避光冰上孵育30 min。将1 mL PBS分别加入各个流式管中，对于过剩的荧光抗体则使用缓冲溶液予以洗涤，同时再重复3次进行低速离心操作，每次时间控制在5 min。将沉积的细胞进行清理，各个试管中加入100 μL PBS缓冲液重悬，之后再进行检验。

1.7 Western blot检测STAT3、p-STAT3蛋白表达水平

细胞在RIPA缓冲液中裂解。总蛋白浓度相同并转移到PVDF膜。在进行密封之后置于4℃的环境下孵育一抗24 h。孵育后的条带在Tris-buffered saline Tween（TBST）缓冲液中进行3次洗涤操作，同时，置于室温孵育二抗，时长为60 min。对于蛋白的表达情况使用增强型化学发光试剂盒予以检测，最后再通过Image J灰度予以相关性研究。

1.8 统计学方法

用 GraphPad Prism5.0统计所得实验数据，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，对于所得结果借助单因素方差进行数理化分析，同时进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 联氨基姜黄素体外可显著抑制SCL-1细胞增殖

浓度不一的联氨基姜黄素处理SCC细胞系SCL-1 2 d后，通过MTT对细胞的活性程度予以检测。最后发现，与对照组相比，处理后的细胞活性显著下降（图1）。联氨基姜黄素半数抑制浓度值（IC50）最大则为18.7 μM。则充分说明在体外使用联氨基姜黄素也可有效抑制SCC细胞的成熟速度。

2.2 联氨基姜黄素抑制DMBA/TPA诱导的SCC形成

处理组在TPA溶液涂抹3 d后，每日给予联氨基姜黄素灌胃处理。每周检测1次肿瘤组织，当肿瘤组织平均直径大于1 mm后，每周记录1次两组小鼠肿瘤组织直径。发现联氨基姜黄素处理组小鼠肿瘤组织增长明显受抑（图2A），差异有统计学意义（P<0.05）。浓度相似的联氨基姜黄素处理正常 C57BL/6小鼠，在对小鼠体重变化的记录中得知，两个小组均没有任何差异（图2B）。证明在小鼠可耐受药物浓度下，联氨基姜黄素可显著抑制SCC进展。

2.3 联氨基姜黄素诱导肿瘤树突状细胞成熟

取SCC模型肿瘤组织研磨行细胞流式检测，发现联氨基姜黄素可改善抑制性的肿瘤免疫微环境。通过小组比较发现，处理组树突状细胞更为成熟（封三图3），差异有统计学意义（P<0.05）。提示联氨基姜黄素可通过促进抗原提呈细胞功能状态抑制SCC进展。

2.4 联氨基姜黄素抑制树突状细胞STAT3通路

将小鼠骨髓中的单核细胞提取出来，之后再借助rmGM-CSF联合IL-4诱导分化为树突状。联氨基姜黄素孵育24 h后，Western blot研究STAT3通路蛋白水平改变情况。实验结论发现，联氨基姜黄素孵育后STAT3总蛋白不变，磷酸化水平明显降低（封三图4）。Image J灰度分析得出，差异有统计学意义（P<0.05）。则说明树突状细胞蛋白磷酸化在被联氨基姜黄素抑制以后，会使得树突状细胞加快分化。

3讨论

随着人口老龄化危机的到来，皮肤癌的发病率将逐渐上升[7，8]。SCC在皮肤恶性肿瘤中占据很大比重。侵袭性SCC将在较大程度上影响死亡的可能性。虽然SCC可与外科手术、放射和化疗单独或组合地进行处理，患有转移性SCC预后依旧亟需改进[9，10]。如何对传统的疗法进行优化和创新，是当前医学研究中急需解决的重大难题。

结合一系列的分析得知，对于癌细胞的控制，联氨基姜黄素可起到显著的抑制效果。由于姜黄素具有多种抗癌特性，在乳腺癌、肝癌等多种实体瘤中展现出令人瞩目的杀伤效果。因此多项临床试验相继开展来研究联氨基姜黄素的抗肿瘤效果[11，12]。体外实验中，研究证明联氨基姜黄素可通过介导STAT3去磷酸化、抑制p38 MAPK通路等多种机制影响肿瘤细胞的生命活动。除外还有专家分析得知，联氨基姜黄素可借助抑制STAT3通路重编程肿瘤相关巨噬细胞向型极化，进而对乳腺癌的恶化起到明显的抑制效果。本研究发现联氨基姜黄素可在体外显著杀伤SCC细胞系SCL-1。同时，利用DMBA/TPA两步诱导法建立的SCC小鼠模型验证了联氨基姜黄素在体内抑制SCC的进展。

为深入研究联氨基姜黄素如何有效地抑制SCC小鼠模型，本研究通过细胞流式實验发现，联氨基姜黄素处理可显著诱导 SCC组织中抗原提呈细胞树突状细胞的成熟与分化，激活抗肿瘤免疫，进而抑制 SCC的发展。在整个免疫系统中，比较重要的抗原呈递细胞（APC）是树突状细胞，在提升机体的免疫能力方面其作用较显著[13-15]。通过对肿瘤细胞进行吞噬，可使抗肿瘤免疫力被激活。最近几年，抗肿瘤免疫治疗技术显著提升，因此，医学界对树突状细胞在抗肿瘤免疫中所产生的影响高度重视[16，17]。前期研究发现，STAT3是抑制树突状细胞成熟的重要因素[18]。转录调节子STAT3在脊椎动物发育和成熟组织功能（包括控制炎症和免疫）中起关键作用。在多种肿瘤中检测到异常/不受抑制的STAT3活性，从而驱动多种促癌功能。为此，STAT3被广泛认为是一种癌基因，并且是大量翻译研究的对象。然而，该因素的显著特征之一是其在不同条件下引起不同的、有时是相反的效果的能力。根据肿瘤病因/突变情况，STAT3的活性已被证明是促癌或抑制肿瘤，提示强调其功能的分子基础仍不完全清楚[19-20]。因此本研究利用 Western blot实验验证发现，联氨基姜黄素通过抑制 STAT3蛋白磷酸化水平，促进CD80/CD86表达，诱导树突状细胞的成熟。

综上所述，本研究首次发现联氨基姜黄素抗SCC的功能，并利用自发性SCC小鼠模型探讨联氨基姜黄素对SCC肿瘤免疫微环境的影响。最后分析得出，对于STAT3的磷酸化，联氨基姜黄素可起到显著的抑制作用，与此同时，还可加快树突状细胞的分化，最终达到抑制肿瘤恶化的目的。本研究认为，联氨基姜黄素作为一种成熟的临床用药，可为SCC治疗提供新方向，具有重要的理论价值和临床意义。

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（收稿日期：2020-05-08）