油茶叶绿体基因组特征及其系统分类*

周安佩 陈曦颜 梁坚坤

(1九江学院江西油茶研究中心 江西九江 332000；2江西农业大学园林与艺术学院 江西南昌 330000；3凯里学院建筑工程学院 贵州凯里 556011)

山茶属是山茶科中种类最多的一个属，共约20个组超280种[1]。中国是山茶属植物的主要富集区域，包含4个亚属(茶亚属、山茶亚属、原始山茶亚属、后生山茶亚属)238个种，其属内许多植株具有较高的观赏和经济价值[1-3]。油茶是山茶属中具有生产价值的油用物种的统称，是世界四大木本油料植物之一，油茶种子的不饱和脂肪酸达90%以上，其中油酸含量约80%，亚油酸8%，高于目前市场中其他常见食用油，是世人所公认为优质的食用油之一[4-6]。然而，油茶的系统进化关系尚不明确，仅依赖于形态学特征确定其进化关系。

叶绿体为植物特有的细胞器，内含一个双链共价闭合环状DNA(Chloroplast DNA，cpDNA)，但缺乏组蛋白包裹和超螺旋结构[7-8]。cpDNA由一个长单拷贝序列(LSC)、短单拷贝序列(SSC)，以及连接他们的两个反向重复序列(IRa和IRb)构成，尽管cpDNA大小不同，但基因组结构十分保守，所含基因的数目差异较小[9-10]。早期利用叶绿体若干基因片段作为植物分类的条形码，可作为科及以上分类单元的有效分类工具，而以整个叶绿体基因组作为植物分类的超级条形码，已逐渐应用于属和种的分子辅助分类[11-12]。基于此，该研究利用普通油茶DNA全基因组高通量测序数据组装成完整的叶绿体基因组，解析其基因组特征，并构建山茶属的叶绿体基因组进化树，探讨油茶的系统分类位置。

1材料与方法

普通油茶DNA高通量reads数据来自于NCBI的SRA公共数据库(SRP216592)，采用Bowtie2软件[13]建立reads比对索引，通过GetOrganelle软件[14]进行reads比对过滤，获得叶绿体基因组相关reads，并通过SPAdes软件[15]进行序列组装，获得的fastg序列导入Bandage软件[16]进行数据筛选，获得LSC、SSC和双向重复的IR区域，组装出叶绿体基因组fasta序列。根据参考基因组的注释信息(GenBank登录号：KY406750.1)，用Geneious软件(Biomatters Ltd， Auckland， New Zealand)对油茶进行注释，获得完整的叶绿体基因组序列和注释信息。

在NCBI中下载茶属物种的叶绿体基因组，包含4个亚属13个组44个种共46份样。以石笔木的叶绿体基因组(GenBank登录号：KY406765.1)为外类群，采用MrBayes软件[17]的Bayes模型构建系统发育树，其进化模型通过JModeltest[18]比较分析，以AIC为准则进行筛选，采用马儿科夫链(Markov Chain Monte Carlo Process)的蒙特卡洛法，以随机树为起始，运行1000000代，每100代抽样1次，舍弃掉2500个老化样本(占25%)后，以剩余样本构建一致树。

2结果与分析

2.1叶绿体基因组特征分析

如表1所示，组装出来的油茶叶绿体基因组大小为156，939 bp，GC含量为37.3%。其中大环LSC长86 644bp，小环SSC长18 407bp，反向重复序列区域IR长25 944bp。整个基因组共检测到132个基因，其中蛋白编码基因数为87个(15个含有内含子)，tRNA的数量为37个(8个含有内含子)，rRNA数为8个，叶绿体基因组特征见图1。

比较已公布的油茶叶绿体基因组，其基因组长度变幅为156939～156995bp，仅相差56 bp。除NC 023084.1外，3株油茶样本的叶绿体基因组LSC区域的长度差异较小，仅为9 bp、而SSC区域和IR区域的长度差异较大，分别为111 bp和83 bp。样本NC 023084.1的SSC长度偏大(>5041bp)，IRa和IRb区域的长度不相等，表明其基因组序列和注释有误。4株油茶样本的基因数量变幅为132～136，主要表现于tRNA数量的变化。

表1 不同油茶叶绿体基因组特征的比较

图1 油茶叶绿体基因组的基因分布图

2.2油茶的系统进化地位

基于叶绿体全基因组序列的Bayes系统发育树显示，山茶属物种的进化关系十分复杂。除疏齿大厂茶(金花茶组)外，茶亚属中的茶组与金花茶组具有明显不同的分类位置。金花茶组物种可分为2个组，其中金花茶、龙州金花茶、中东金花茶3个种组成第1个组，且与五柱滇山茶(原始山茶亚属)的构成一个大组，其余金花茶组物种全部归为第2个组。山茶亚属的分类较为混乱，分布于进化树的各级分支，其中毛药山茶(红山茶组，山茶亚属)与后生山茶亚属的尖连蕊茶和长管连蕊茶聚为一个分支，而红山茶组的毛蕊红山茶、怒江红山茶、西南红山茶与毛柄连蕊茶(后生山茶亚属)和丹寨秃茶(秃茶组，茶亚属)具为一个分支。小黄花茶属山茶亚属的小黄花茶组，但却与茶亚属茶组植物亲缘关系较近。山茶亚属的油茶组的分类位置较为明确，其所有物种和红山茶组少数物种能聚集在一个大分支中，越南抱茎茶(未分类)、皱叶瘤果茶(未分类)和大苞山茶(原始山茶亚属)也可归入该分支。4份油茶样本中，除MF541730.2外，其余三株均与落瓣油茶的亲缘关系最近。

3结论与讨论

高等植物体内含有3套基因组信息，分别为核基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组。其中线粒体基因组进化速率较慢，分子内重组现象广泛，并不适合用于系统分类进化研究[19]。而核基因组的结构复杂，需大量筛选单拷贝或低拷贝的直系同源基因，限制了其在系统发育研究中的应用[20]。叶绿体基因组进化速度适中，其基因几乎不受旁系同源基因的干扰，且均单系遗传，避免了基因重组现象，十分适合用于物种的系统发育和分类位置研究[21]。Shi等[22]首先鉴定出了油茶的叶绿体基因组(NC023084.1)，并分析了其中ycf15基因的进化模式。Zhang等[23]对栽培于海南的普通油茶叶绿体基因组(MF541730.1)进行了特征描述。Yu等[24]在对山茶科多样化历史研究中也组装获得了普通油茶的叶绿体基因组(KY406750.1)。该研究组装获得的叶绿体基因组与以上3份基因组的特征相似，其总长度和LSC区域长度的差异较小，分别为56 bp和9 bp，而SSC区域和IR区域的长度差异则较大，分别为111 bp和83 bp。4份样本的CDS数和tRNA数均无差异，分别为87个和8个，其gene数差异主要在于tRNA的数量不同，该研究的tRNA数为37个，与样本KY406750.1和NC023084.1的一致，但少于样本MF541730.1的39个，此不同结果可能与基因组的组装注释分析方法有关。

中国具有悠久的油茶栽培和利用历史，在南方各省市县均有广泛的人工栽培林，相应的加工利用也越来越深入和广泛，是中国大力发展的脱贫攻坚产业[25-26]。然而，山茶属的系统进化研究较为落后，主要基于形态特征进行划分，而基于分子数据的系统发育分析较少。普通油茶为山茶属中分布最广的物种之一，其分类位置尚不明确，秦声远[27]对油茶系统发育进行了分析，结果显示，来自于比较转录组的450个直系同源基因支持油茶组独立，将油茶组物种划分为一个单独的分支，部分短柱油茶组物种可以归并入油茶组。本研究基于叶绿体全基因组构建的Bayes树支持油茶组的独立，且与同亚属红山茶组的山茶(C. japonica)、浙江红山茶(C. chekiangoleosa)、杜鹃红山茶(C. azalea)，以及短柱茶(C. brevistyla，山茶亚属短柱茶组)、红皮糙果茶(C.crapnelliana，山茶亚属糙果茶组)和大苞山茶(C.granthamiana，原始山茶亚属古茶组)聚为一个大分支。落瓣油茶(C.kissii)与普通油茶具有最近的亲缘关系，其叶绿体基因组序列差异小于普通油茶种内不同个体的差异，可考虑进行种的合并。