基于染料Genefinder的荧光传感体系检测玉米赤霉烯酮

郭婷，陈金航，周鸿媛，张宇昊，马良

(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是由镰刀菌属真菌产生的一种毒素[1]，广泛存在于玉米、小麦、大米等谷物、饲料和动物制品中。ZEN具有类雌激素作用，进而影响人体和动物的生殖系统[2-3]。此外，ZEN还具有免疫毒性、肝肾毒性及致癌性[4-5]。我国国标规定小麦及玉米中ZEN含量不超过60 μg /kg，饲料中ZEN含量不超过500 μg/kg。目前，食品中ZEN的检测方法有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6-10]、免疫法[11-14]、生物传感器法[15-18]等。高效液相色谱法准确度和稳定性较高，但需要复杂的样品前处理及昂贵的仪器设备，不能满足食品安全快速检测的要求。免疫分析法具有高效、快速的特点，但其会出现假阳性问题，并且抗体的制备周期较长、稳定性差，限制了该方法的应用。

适配体是一种单链DNA或RNA，通过指数富集(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)系统筛选产生，能够与靶标进行特异性结合，稳定且易制备，在4 ℃条件下能保存半年甚至更久，不会影响其结构[19-21]，目前已广泛应用于食品安全检测及疾病诊断方面。HE等[22]利用适配体的特异性构建基于内滤效应的荧光比率分析法检测ZEN和伏马毒素，该方法选择性高，实际样品加标回收率在89.9%～106.6%。ZHANG等[23]通过SELEX法筛选出ZEN适配体，并建立基于纳米金的无标记可视化方法检测ZEN。HE等[24]构建基于纳米材料和适配体的高灵敏的电化学传感方法成功用于ZEN检测，其中纳米材料(CoSe2/AuNRs和DNA-PtNi@Co-MOF)的主要作用是放大检测信号，该方法的检出限为1.37 fg/mL。另有新型3D樱花状金属有机框架材料也可用于电化学信号放大，该方法检出限可达0.45 fg/mL[25]。本课题组也开发了多种适配体荧光传感器检测黄曲霉毒素、展青霉毒素等真菌毒素[26-28]。

Genefinder染料是一种新型花青素类核酸染料，与双链DNA作用后荧光会增强800～1 000倍，毒性低、灵敏度高[29-30]，可以有效保护实验人员和环境，常用于电泳中核酸染色[30-31]，在检测方面的研究较少。因此，本研究利用核酸适配体的特异性，结合荧光染料Genefinder特殊的荧光特性构建荧光传感体系，用于简单、高灵敏、快速检测ZEN。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-2450紫外分光光度计,日本岛津公司；F-2500荧光分光光度计,日本日立公司；台式高速离心机,德国Eppendorf公司。

ZEN适配体(5′-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG-3′)[32]，互补链(5′- TCAAATTAAAGATAATAATGTATTATAGAT-3′)，生工生物工程(上海)有限公司；染料Genefinder，合肥博美生物科技有限责任公司；ZEN、黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFG1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、单端孢霉烯(T-2)毒素标准品，美国Sigma公司；玉米粉购于本地超市。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA浓度测定

DNA浓度以单链浓度表示，利用紫外-可见分光光度计测定DNA在260 nm处的吸光度，依据朗伯比尔定律(A=εbc)计算得DNA的浓度，于-20 ℃备用。

1.2.2 荧光传感器对ZEN的检测

DNA备用溶液解冻后，水浴90 ℃处理10 min，逐渐冷却至室温备用。将ZEN适配体与等体积等浓度互补链混合，再加入一定浓度ZEN孵育一段时间后，加入2 μL Genefinder100×，测定荧光光谱(激发波长500 nm)。

1.2.3 实际样品中ZEN的检测

向玉米粉样品中加入一定量ZEN，分别配成质量浓度为5、20 μg/L的阳性样本。用90%(体积分数)乙腈水溶液超声提取30 min，离心后取上清液，氮吹吹干后加入缓冲溶液，按照构建的荧光传感体系检测ZEN。

2 结果与分析

2.1 检测原理

本研究利用Genefinder的特性构建荧光传感体系用于快速检测ZEN。检测原理图如图1-A，ZEN适配体与其互补链形成双链结构，Genefinder染料与双链结构DNA作用后产生较强的荧光，当加入毒素ZEN后，适配体优先识别ZEN，双链打开，Genefinder染料荧光猝灭。首先研究方法的可行性，以500 nm作为激发波长，观察不同条件下体系荧光信号的变化情况。图1-B显示单链适配体(a)及互补链(b)与Genefinder作用后显示出较微弱的荧光信号。ZEN适配体与其互补链形成双链结构，Genefinder染料与双链结构DNA结合后荧光信号明显增强(d)，加入毒素ZEN后，适配体与ZEN结合，双链打开，Genefinder染料荧光强度降低(e)。根据荧光强度的改变检测目标物ZEN的含量。

a-ZEN适配体+Genefinder;b-互补链+Genefinder;c-40 μg/L ZEN;d-ZEN适配体+互补链+Genefinder;e-ZEN适配体+互补链+40 μg/L ZEN+GenefinderA-传感体系的检测原理图;B-不同条件下荧光光谱图1 传感体系原理图及可行性分析Fig.1 Schematic of sensing system and feasibility

2.2 检测条件优化

2.2.1 孵育时间

实验中适配体需要与目标物孵育一段时间才能更好地识别目标物。因此本试验研究孵育时间对荧光信号的影响。如图2所示，随着孵育时间的延长，荧光猝灭量逐渐增强，当孵育时间60 min时，荧光猝灭量达到最大，说明体系中ZEN适配体与ZEN结合已达到饱和。因此，本实验选择60 min为最佳孵育时间。

图2 孵育时间对荧光强度的影响Fig.2 Effect of incubated time on the fluorescence注：F0和F分别表示没有目标物和添加目标物时的荧光强度(下同)

2.2.2 适配体用量

适配体用量会影响荧光传感体系的灵敏度。图3显示适配体浓度对荧光传感体系的影响。结果表明，随着ZEN适配体用量的增加，荧光猝灭程度迅速增加，当适配体浓度达到100 nmol/L时，荧光猝灭量趋于稳定。因此，适配体用量选择100 nmol/L作为后续实验用量。

图3 适配体用量对荧光强度的影响Fig.3 Effect of aptamer on the fluorescence

2.3 荧光传感体系的构建

在上述最佳的实验条件下，以ZEN为目标物构建荧光传感体系。结果如图4-A所示，随着ZEN浓度的增加，传感体系荧光强度逐渐减弱，这是由于ZEN的加入破坏了双链结构，从而造成荧光减弱。然而当ZEN浓度达到一定值时，荧光强度不再明显降低，达到平衡。从图4-B可以看出，1-F/F0与ZEN浓度的对数在0.1～200 μg/L呈线性关系，实际可检测的检出限为0.1 μg/L。结果表明该荧光传感体系具有较高的灵敏度。

a-0 μg/L;b-0.1 μg/L;c-0.5 μg/L;d-1 μg/L;e-5 μg/L;f-10 μg/L;g-50 μg/L;h-100 μg/L;i-200 μg/L;j-500 μg/LA-不同浓度ZEN对所构建传感体系荧光响应变化；B-1-F/F0与ZEN浓度对数的线性关系图4 传感体系对ZEN的荧光响应Fig.4 Fluorescence resptnse of sensor with ZEN

2.4 荧光传感体系选择性

为了考察荧光传感体系的选择性，本研究以黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、赭曲霉毒素A(OTA)、单端孢霉烯毒素(T-2)为对照毒素研究该传感体系的特异性，结果如图5所示。加入40 μg/L ZEN时，荧光传感体系的荧光强度猝灭量显著增加，而加入同浓度的对照毒素并未造成荧光体系明显的荧光猝灭，这是因为传感体系中使用的适配体与ZEN可以特异性结合，而与其他毒素无明显作用。结果表明该传感体系对ZEN具有较好的选择性。

图5 方法选择性Fig.5 Selectively of sensing system注：ZEN质量浓度为40 μg/L，其他对照毒素质量浓度均为40 μg/L

2.5 实际样品测定

为了考察传感体系实际测定效果，以玉米粉作为实际阴性样品，研究加标回收情况。结果如表1所示，利用传感体系检测的加标回收率在100.4%～105.8%，这说明该荧光传感体系可用于真实复杂样品中ZEN的测定。

表1 实际样品加标回收率(n=3)Table 1 Real sample spike recovery (n=3)

3 结论

本研究构建了一种基于Genefinder和适配体的荧光传感体系检测ZEN，在最优条件下，传感体系的线性范围为0.1～200 μg/L，实际检出限为0.1 μg/L，并成功用于出玉米粉中ZEN的测定，加标回收率在100.4%～105.8%。本方法为开发简单、快速、灵敏的生物传感体系开辟了新的途经。