桑葚果渣固态发酵醋有机酸及风味特征分析

吴震，吴煜樟，陈莉，汪沙，李荣源，卢红梅*

1(贵州大学, 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳，550025)2(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳，550025)

桑葚又名桑果、桑葚子、桑乌等，口味甜中略酸，富含花青素、多酚、氨基酸、有机酸等营养成分，具有重要的研究与开发价值[1-3]。然而新鲜的桑葚不易存放，通常用于加工果汁、果酒等产品，在此过程中会产生大量的果渣，这些果渣中仍残留着花青素、多酚等有效物质，多数情况下被用作肥料或作为垃圾倾倒填埋，造成了环境污染和资源浪费[4]。桑葚果树在生长过程中需要定期剪枝修叶，桑叶作为中医传统药材，含有多糖、黄酮、生物碱等活性成分，因此对桑葚果渣及桑葚果园的废弃桑叶进行回收并加以利用具有较大的潜在价值和应用前景[5]。

果醋是以果品或果品加工下脚料为主要原料，利用微生物发酵技术酿制的酸性饮品或调味品，具有抗氧化、抗疲劳、降糖降脂等多种功效[6]。果醋的生产主要以鲜果榨汁进行液态发酵获得，但由于原料的单一性使产品口感和风味受到了一定的限制。采用固态发酵制备果醋可以改善产品风味和色泽，更容易被消费者接受。

本实验以桑葚果渣为主要原料、桑叶为辅料，采用固态发酵方式制备桑葚果渣醋，以常规液态发酵的桑葚果醋作为对照，对产品的理化指标以及发酵过程中有机酸和挥发性风味物质的变化进行分析，旨在为桑葚副产物资源化利用提供新思路，增加桑葚产品的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活性干酵母BV818，湖北安琪酵母股份有限公司；巴氏醋酸菌GIM1.158，广东省微生物菌种保藏中心。

桑葚果汁、果渣、桑叶，贵州省开阳县某有限公司；桑叶用水清洗，60 ℃条件下烘干并打碎至10～20目备用。

芦丁标准品，北京索莱宝科技有限公司；酒石酸，成都金山化学试剂有限公司；没食子酸、乳酸、草酸、柠檬酸、乙酸，天津科密欧化学试剂有限公司；L-苹果酸、琥珀酸，麦克林生化科技有限公司；试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Pegasus BT气相色谱飞行时间质谱仪，美国力可公司；高效液相色谱仪(配置G1329B自动进样器、G1311C四元低压梯、G1316A柱温箱、G1315D二极管阵列紫外-可见光检测器)、ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美国安捷伦公司；722 s可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；ZD-2A自动电位滴定仪，上海大普仪器有限公司；LD-3D离心机，上海上登实验设备有限公司。

1.3 果醋生产方法

1.3.1 桑葚果醋酿造工艺

固态发酵桑葚果渣醋工艺如下：

液态发酵桑葚果汁醋工艺如下：

1.3.2 操作要点

(1)菌种活化与培养

酵母菌活化：称取活性干酵母于含糖量为20 g/L的糖水中，在37 ℃下活化25 min。

醋酸菌活化：将斜面保藏菌种接种至基础培养基(1%葡萄糖，1%酵母膏，3.5%无水乙醇,均为质量分数),在30 ℃，150 r/min条件下培养48 h制备1级种子液，再将1级种子液以10%接种量制备2级种子液。

(2)调配、酒精发酵

果渣组在添加20%(质量分数)桑葚汁后与果汁组分别加入蔗糖调整至总糖含量为14%(质量分数)，以干酵母0.4 g/L的添加量加入酵母活化液，于26 ℃条件下发酵至酒精度和还原糖含量趋于衡定。

(3)醋酸发酵

果渣组添加辅料后与果汁组接入12%(体积分数)醋酸菌种子液，于32 ℃条件下发酵至总酸含量和酒精度趋于衡定(果渣组每24 h搅拌1次醋醅，果汁组采用150 r/min摇瓶发酵)。

(4)淋醋及灭菌[7]

醋醅与水按质量比1∶1.2浸泡7～9 h，再称取新醋醅浸泡到头醋液中，反复套淋3次，所得醋液过滤后于70 ℃下灭菌25 min。

1.4 产品品质分析

1.4.1 理化指标测定

总酸含量(以乙酸计)测定[8]参照GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》；不挥发酸含量(以乳酸计)测定[9]参照GB 18187—2000《酿造食醋》；多酚含量[10]采用福林酚法测定，分别以吸光值和没食子酸浓度为纵坐标和横坐标建立标准曲线，回归方程为y=0.012 4x+0.006 6(R2=0.999 0)；黄酮含量[11]参照GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》分别以吸光值和芦丁浓度为纵坐标和横坐标建立标准曲线，回归方程为y=0.442 1x+0.003 4(R2=0.999 1)。

1.4.2 有机酸测定[12]

取样：(1)果醪：添加果汁及蔗糖后的桑葚果渣醪；(2)酒醪：桑葚果渣酒精发酵结束时的醪液；(3)果渣醋：桑葚醋醅所淋醋液；(4)果汁醋：桑葚果酒醋酸发酵结束时醋液。

样品处理：取样品10 mL以4 000 r/min离心20 min，取上清液过0.22 μm滤膜待测。测定条件：ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温35 ℃，波长210 nm，进样量10 μL，流速：0.00～4.00 min流速为1.0 mL/min；4.00～10.00 min流速为0.30 mL/min；10.00 min后流速为1.0 mL/min。

选取草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸标准品配成一定浓度梯度混合进样，以各种有机酸的质量浓度(g/L)为横坐标，色谱峰的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.3 挥发性风味物质分析[13-14]

取5.0 mL液体样品(或5.0 g固体样品)于顶空瓶中，将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。GC条件：DB-Wax色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为氦气，进样口温度250 ℃，流速1.0 mL/min，起始温度40 ℃，初始时间3 min；然后以10 ℃/min升至230 ℃，保留5 min。MS条件：发射电流1 mA；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃。各种化合物相对含量采用归一化法计算获得。

1.5 数据处理

采用Microsoft Office 2016、Origin 2017、SPSS 26.0、RStudio等软件对数据进行处理、作图。

2 结果与分析

2.1 桑葚果醋理化指标分析

由表1可知，桑葚果渣醋的总酸含量低于桑葚果汁醋，这可能是由于发酵周期较长所造成的部分损失以及固态酿造的淋醋工艺所致。不挥发酸是衡量食醋品质的一项重要指标，其作用在于调和食醋酸味，桑葚果渣醋中不挥发酸含量高于桑葚果汁醋，可以使果醋口感更加柔和、具有回味[15]。桑葚果渣醋的总酚和总黄酮含量分别达到桑葚果汁醋的1.5和1.7倍，具有显著性差异(P<0.05)，桑叶是多酚、黄酮等抗氧化物质的有效来源，许多品种的桑叶均表现出较好的抗氧化活性，推测桑葚果渣醋中较高含量的多酚、黄酮与桑叶的添加有关[16]。

表1 不同桑葚果醋理化指标检测结果 单位：g/L

2.2 桑葚果醋的有机酸组成

表2列举了桑葚果渣醋不同发酵阶段样品中7种有机酸的含量。在果渣醋的发酵过程中，草酸、酒石酸、苹果酸含量呈逐渐降低的趋势，乳酸和柠檬酸含量呈现先升高后降低的趋势，这与陆燕等[17]在利用桑葚汁制备果醋研究中的变化一致。乙酸在醋酸发酵前变化较小，经过醋酸菌代谢后逐渐增加，最终达到45.83 g/L。琥珀酸是酵母代谢的重要产物，是果渣醋发酵过程中唯一呈上升趋势的有机酸。

表2 不同桑葚样品中有机酸含量 单位：g/L

由表2可知，桑葚果渣醋和果汁醋的有机酸组成存在较大差异，果醋的口感与不挥发酸含量及占比存在一定关联，果渣醋中较高比例的乳酸、柠檬酸、琥珀酸等不挥发酸能调和果醋酸味，减少乙酸对味觉的刺激，使得果醋口感更加柔和[18]。除乙酸和酒石酸外，果渣醋中其他有机酸含量均高于果汁醋，这可能与辅料的添加以及微生物代谢情况的差异有关。

2.3 桑葚果醋及固态发酵过程中风味物质分析

2.3.1 桑葚样品挥发性风味物质组成及相对含量对比分析

采用GC-MC法从固态发酵的桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及液态发酵的桑葚果汁醋样品中共检测出264种挥发性风味物质。对4种桑葚样品各类风味物质进行统计学分析，如图1所示。

a-种类对比图；b-相对含量对比图图1 桑葚样品中风味物质分类统计图Fig.1 Substance classification statistics of flavor substances in mulberry samples

桑葚果醪、酒醪、果渣醋中分别检测出挥发性风味物质105、145、132种，桑葚果渣醋发酵过程风味物质种类呈先增加后减少的趋势，这与管冠宇[19]在液态发酵制备桑葚果醋的研究中风味物质变化趋势一致。酯类物质的相对含量始终占有较高比例，果醋中的酯类多具有较高的气味活性值(odor activity value，OAV)，如乙酸异戊酯(OAV=56，呈香蕉香味，果渣醋中相对含量为1.81%)、己酸乙酯(OAV=8.7，呈菠萝香味，果渣醋中相对含量为2.31%)等，均对果醋整体的香气产生积极的贡献[20]。果醪与酒醪中酸类物质组成较为接近，醋酸发酵后酸类物质的种类及相对含量明显增加，其中乙酸从6.92%增加到30.21%，异戊酸、己酸、乳酸等均为这一阶段所产生。醇类物质相对含量变化较大，酒精发酵后增加9.59%，这一阶段酵母菌产生大量乙醇，同时产生正己醇、异戊醇、异丁醇等大量高级醇副产物；醋酸发酵阶段减少11.53%，主要为醋酸菌代谢消耗以及大量醇类物质与酸类物质发生酯化反应造成[21]。醛酮类物质在发酵过程中变化较小，其中苯甲醛、3-羟基-2-丁酮含量较高，苯甲醛贡献蜜甜香，后者在食醋中较为常见，具有奶香味[22]。烃类物质主要以烷烃为主，酒精发酵后烃类物质增加了33种，随后减少到12种，但相对含量始终较低。

果汁醋中共检测出86种挥发性风味物质，以酸类、酯类和醇类物质为主，除醛类外，果渣醋中各类风味物质数量均大于果汁醋，这表明桑葚果渣醋具有更加丰富的香气成分。LU等[23]对比了以液态发酵和半固态发酵生产胡柚果醋的品质差异，发现半固态发酵样品风味物质种类更多，推测可能是辅料的添加或微生物代谢情况不同所致。果渣醋的酯类物质种类较果汁醋多出18种，但相对含量却略低于果汁醋，其中乙酸异戊酯相对含量最高，其次是乙酸苯乙酯；而果汁醋中相对含量最高的是乙酸乙酯，其次是乙酸异戊酯。乙酸异戊酯具有香蕉气味，乙酸苯乙酯带有玫瑰香，乙酸乙酯则具有令人愉悦的果香[24]。酸类是果醋的主体风味物质，果渣醋和果汁醋中乙酸相对含量分别为30.21%和30.70%，异戊酸、乳酸等酸类物质可以使果醋酸味更加丰富、柔和。2种果醋中醇类物质呈现种类少、相对含量高的特点，其中苯乙醇、异戊醇含量丰富，苯乙醇赋予果醋玫瑰花香、蜂蜜味，异戊醇则具有白兰地酒香，它们使得果醋风味浓郁、风格更加突出[25]。

为继续探究不同桑葚样品中风味物质结构的异同，利用Upset Plot将桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及果汁醋中风味物质的重叠情况进行可视化处理，如图2所示。

图2 桑葚样品中风味物质的Upset plot分析Fig.2 Upset Plot analysis of flavor substances in mulberry samples

在检测出的264种风味物质当中，4种桑葚样品共同存在34种风味物质，表明果醪、酒醪、果渣醋和果汁醋的风味特征具有一定的相似性。如果将仅出现在某一样品中的风味物质称为“特征成分”，则4种桑葚样品的特征成分数量呈酒醪>果渣醋>果醪>果汁醋的关系，这与其各自所含风味物质种类的数量关系一致，果渣醋与果汁醋的特征成分分别为50种和16种，进一步说明以固态发酵所得的桑葚果渣醋具有更加复杂的风味物质结构及风格特征。此外，仅果醪、酒醪和果渣醋中共同检测出的风味物质有辛酸甲酯、苯乙醛等17种，表明这些物质主要来源于桑葚果渣，且发酵过程中保留效果较好。仅果渣醋和果汁醋中共同检测出的风味物质有正癸醛、α-松油醇等7种，这些物质可能是对桑葚果醋风味特征贡献较大的成分。

由此可见，以桑葚果渣固态发酵制备果醋相较于液态桑葚醋具有更加丰富的风味物质，因此，本研究继续探究桑葚果渣醋发酵过程中主要风味物质组成并进行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2.3.2 桑葚果醋固态发酵过程中主要挥发性风味物质的PCA

桑葚果渣固态发酵过程中果醪、酒醪、果渣醋中相对含量大于1%的风味物质(表3)主要有乙酸、乙酸乙酯、苯乙醇等22种成分，对这22种成分进行PCA，结果如图3所示。

表3 桑葚果渣醋发酵过程中样品相对含量>1%的风味物质 单位：%

图3 桑葚发酵过程中样品主要风味物质的主成分分析Fig.3 PCA of the main flavor substances of samples during the fermentation of mulberry pomace vinegar

由图3可知，PC1主要与异丁醇、庚酸乙酯、乙醛等物质呈正相关，与乙酸、乳酸、乙酸苯乙酯等呈负相关，其中异丁醇对PC1贡献最大，发酵过程中呈逐渐下降的趋势。PC2主要与正己酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醇等物质呈正相关，与己酸、异戊醇、正己醇等呈负相关，其中正己酸乙酯对PC2贡献最大，发酵过程中呈先升高后降低的趋势。果醪、酒醪、果渣醋分别位于第四、第一、第三象限，表明发酵过程中样品的主要风味物质组成产生了较大变化。

3 结论

本试验采用固态发酵方式，以桑葚果渣为原料、桑叶为辅料制备桑葚果醋。分析表明，桑葚果渣醋的总酸含量为49.84 g/L，不挥发酸、总酚、总黄酮含量分别为7.25、2.72、2.16 g/L，均高于桑葚果汁醋。在果渣醋发酵过程中，草酸、酒石酸、苹果酸含量降低，琥珀酸含量升高，果渣醋中草酸、乳酸、琥珀酸含量明显高于果汁醋。采用气相色谱-质谱联用技术从桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及果汁醋中分别检测出105、145、132、86种挥发性风味物质，相较于果汁醋，果渣醋的风味物质更加丰富，风格特征更加明显。主成分分析表明，桑葚果渣醋在不同发酵阶段主要风味物质结构存在较大差异。

上述分析结果表明以桑葚果渣及桑叶固态发酵制备果醋具有可行性。此外，实验中发现桑葚果渣醋中总酚及总黄酮含量均高于桑葚果汁醋，这可能意味着桑葚果渣醋具有更强的抗氧化活性，后续将针对桑葚果渣醋功能性成分以及保健功效进行研究，为桑葚副产物利用提供更充分的理论依据。